劉永青

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西離石 033000）

克拉維酸（clavulanic acid，CA）又名棒酸，有微弱的抗菌活性，是一種β內(nèi)酰胺酶抑制劑，C2位上有一個(gè)β羥基乙叉取代基，而C6位沒(méi)有酰氧基。它以氧原子取代了青霉素及頭孢菌素惡唑環(huán)中的硫原子，形成3R、5R立體結(jié)構(gòu)[1]，目前主要與各種β內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用以解決細(xì)菌耐藥性問(wèn)題[2]。

棒狀鏈霉菌是克拉維酸的生產(chǎn)菌株，屬于放線桿菌家族，是一種產(chǎn)β內(nèi)酰胺類抗生素的需氧革蘭氏陽(yáng)性菌。通過(guò)基因工程手段對(duì)菌株理論研究的較多，如LI J等[3-5]通過(guò)解析工業(yè)菌株F613-1基因組信息來(lái)破譯其高產(chǎn)機(jī)理；左志晗等[6]在棒狀鏈霉菌NRRL3585基礎(chǔ)上構(gòu)建了lat基因阻斷的突變菌株；áLVAREZ-áLVAREZ R等[7]通過(guò)構(gòu)建oppA2缺失突變體研究克拉維酸生產(chǎn)通路?；谡T變技術(shù)篩選高產(chǎn)菌株的研究主要集中在通過(guò)紫外、亞硝基胍（nitroso-guanidin，NTG）和甲基磺酸乙酯（ethylmethane，EMS）誘變，內(nèi)酰胺酶、鏈霉素、甘油耐受和舒巴坦鈉篩選培育高產(chǎn)菌株[8-12]。

作為克拉維酸合成途徑的前體物質(zhì)，添加精氨酸理論上可以使克拉維酸合成增加，但目前研究結(jié)果不一致[13-15]，可能與菌株、精氨酸濃度有關(guān)。研究表明，添加鳥(niǎo)氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸和賴氨酸都有利于克拉維酸合成[14，16]，覃榮活等[17]研究表明，谷氨酸鹽到精氨酸代謝途徑的基因整體表達(dá)上調(diào)，有利于克拉維酸合成。谷氨酸是多種氨基酸的代謝前體，在氨基酸代謝中處于核心位置，且成本較低，故本實(shí)驗(yàn)采用谷氨酸作為克拉維酸前體添加劑。

甘油衍生物3-磷酸甘油是克拉維酸合成的限速因素[18-19]，所以工業(yè)生產(chǎn)中常把甘油作為添加前體。本試驗(yàn)以工業(yè)生產(chǎn)菌棒狀鏈霉菌F613-1為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)紫外和NTG聯(lián)合誘變處理，篩選高產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳標(biāo)記鑒定。以甘油為碳源添加劑，分別考察添加不同氮源前體——精氨酸和谷氨酸時(shí)菌株的培養(yǎng)效果。在對(duì)高產(chǎn)菌株發(fā)酵研究基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化菌株發(fā)酵條件，為進(jìn)一步提高克拉維酸生產(chǎn)、降低成本提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棒狀鏈霉菌（Streptomyces clavulans）F613-1：由山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心贈(zèng)送；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）相關(guān)酶、引物和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒：北京博凌科為生物科技有限公司；液相試劑均為國(guó)產(chǎn)色譜級(jí)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

固體培養(yǎng)基[17]：0.4%葡萄糖，0.3%胰蛋白胨，1.5%麥芽提取物，2%瓊脂粉，pH調(diào)至7.5；

種子培養(yǎng)基：2%大豆超細(xì)粉，1.2%玉米淀粉，0.5%酵母膏，0.08%磷酸氫二鉀，1.1%三油酸甘油酯，pH 8.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基：3.0%大豆超細(xì)粉，2%大豆蛋白提取物，3.0%麥芽糊精，1.5%三油酸甘油酯，0.1%氯化鉀，0.25%磷酸氫二鉀，0.1%氯化鎂，0.05%氯化鈣，0.01%三氯化鐵，0.02%氯化鈉，0.05%泡沫劑，pH 7.0。

所有培養(yǎng)基均在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SC-04離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國(guó)安捷倫公司；2720 PCR儀：美國(guó)ABI公司；DYY-10C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；HZQ-X700C恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

固體培養(yǎng)：棒狀鏈霉菌F613-1孢子在固體培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)10 d[17]。

種子培養(yǎng)：按106個(gè)/mL接種孢子于種子培養(yǎng)基，25 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：以10%（V/V）的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，25 ℃、300 r/min振蕩培養(yǎng)144 h，250 mL燒瓶裝液量為50 mL。

1.3.2 誘變篩選方法

收集棒狀鏈霉菌孢子制備單孢子懸液（孢子濃度約為107～108個(gè)/mL）。距30 W紫外燈30 cm處照射4 min，然后用6 mg/L的NTG處理40 min，將誘變后的孢子懸液涂布于含60 μg/mL鏈霉素[20]的固體培養(yǎng)平板上，25 ℃培養(yǎng)10 d。取各單菌落涂平板，25 ℃培養(yǎng)5 d，測(cè)定克拉維酸含量。取克拉維酸含量最高的菌落繼續(xù)復(fù)合誘變3次，按上述方法篩選突變株。

1.3.3 遺傳標(biāo)記擴(kuò)增

將出發(fā)菌株F613-1和突變株在種子培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)60 h，3 000×g離心收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌。使用DNA試劑盒提取基因組DNA，根據(jù)GenBank序列代碼AY426768（pah1）和X84101.1（Cas2）進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)以驗(yàn)證遺傳標(biāo)記[21]。pah1上游引物（P1）5'-GCAGCCATATGTCCACCGCCGTCTCCCCGCGCTACGCCCAAC-3'，pah1下游引物（P2）5'-GTGGTGCTCGAGCTACCCCCACCGCTGCCCGGCGAAGTCCAC-3'；Cas2上游引物（C1）5'-GCGCCATATGGCCTCTCCGATAGTTGACTGCACCC-3'，Cas2下游引物（C2）5'-GACTCGAGTCAGCGGCGCGGCGAGAACG-3'。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃、30 s，65 ℃、1 min，72 ℃、3 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用0.7%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.4 不同培養(yǎng)基突變株發(fā)酵研究

將甘油添加量調(diào)至1.5%，比較分別添加0.15%谷氨酸[22]和0.15%精氨酸對(duì)克拉維酸生產(chǎn)的影響，試驗(yàn)在25 ℃、300 r/min、250 mL燒瓶中進(jìn)行，發(fā)酵時(shí)間為144 h，每隔12 h收集并測(cè)定培養(yǎng)物。

1.3.5 突變株發(fā)酵條件的優(yōu)化

以突變株為發(fā)酵菌株，在發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，實(shí)行二段法發(fā)酵。全程300 r/min振蕩培養(yǎng)，36 h之前按25 ℃、pH7進(jìn)行，36 h后分別設(shè)置發(fā)酵溫度（25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃、37 ℃）、pH值（5.5、6、6.5、7、7.5、8）和發(fā)酵時(shí)間（60 h、72 h、80 h、96 h、108 h、120 h）為單一變量，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照響應(yīng)曲面Box-Behnken法，優(yōu)化克拉維酸發(fā)酵條件。為保證結(jié)果的可信度，每次試驗(yàn)平行3次，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果按平均值計(jì)算。

1.3.6 測(cè)定方法

克拉維酸檢測(cè)：誘變菌固體平板培養(yǎng)采用生物效價(jià)法[23]；液體發(fā)酵采用高效液相色譜（HPLC）法[17]。細(xì)胞生物量測(cè)定：樣品3 000×g離心，收集細(xì)胞，雙蒸水洗滌細(xì)胞兩次，65 ℃孵化至恒質(zhì)量。甘油濃度：參照Eliton的方法測(cè)定[24]。谷氨酸、精氨酸濃度：參照2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB）衍生法測(cè)定[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變菌株篩選

經(jīng)過(guò)紫外和NTG復(fù)合處理3次，篩選到1株效價(jià)最高的突變菌株。25 ℃、300 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，可達(dá)4.19 g/L，比出發(fā)菌株提高19.9%。將該菌株平板傳代3次，遺傳穩(wěn)定性良好。

2.2 遺傳標(biāo)記鑒定

以菌株F613-1為對(duì)照，對(duì)突變株的2個(gè)克拉維酸相關(guān)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證突變株是否為棒狀鏈霉菌的衍生菌株，棒狀鏈霉菌F613-1和突變株的PCR擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖1。

由圖1可知，第2和第4泳道為菌株F613和突變株的pah1基因擴(kuò)增產(chǎn)物，長(zhǎng)度均在1 056 bp左右；第3和第5泳道為菌株F613和突變株的cas2基因擴(kuò)增產(chǎn)物，長(zhǎng)度均在978 bp左右。棒狀鏈霉菌F613-1和突變株的PCR擴(kuò)增圖譜相同，說(shuō)明該突變株為棒狀鏈霉菌變種。

2.3 突變株克拉維酸生產(chǎn)研究

精氨酸和3-磷酸甘油是克拉維酸合成的直接前體物質(zhì)，由于成本限制，發(fā)酵時(shí)谷氨酸替代精氨酸添加已成為克拉維酸生產(chǎn)的趨勢(shì)。因此在添加1.5%甘油基礎(chǔ)上，考察谷氨酸和精氨酸對(duì)突變株克拉維酸生成的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，谷氨酸替代精氨酸對(duì)突變株克拉維酸生產(chǎn)影響不大；添加谷氨酸可提高突變株克拉維酸產(chǎn)量，同時(shí)克拉維酸累積至最大值所需時(shí)間提前至72 h。谷氨酸在72 h消耗殆盡，72 h以后突變株克拉維酸產(chǎn)量降低可能與之有關(guān)。36～72 h之間添加甘油和谷氨酸突變株無(wú)論生物量還是克拉維酸產(chǎn)量都較對(duì)照有較大提高，可能與突變株攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能力提高且發(fā)酵液中谷氨酸相對(duì)充足有關(guān)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將谷氨酸添加量控制在0.15%。

為了將甘油和谷氨酸最大限度應(yīng)用于克拉維酸合成，發(fā)酵初始添加0.1%谷氨酸和0.5%甘油，發(fā)酵36 h添加0.05%谷氨酸和1%甘油，突變株實(shí)行二段法發(fā)酵，36 h之前以菌種生長(zhǎng)為主，36 h后以產(chǎn)克拉維酸為主，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件。

2.4 突變株發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵溫度對(duì)克拉維酸產(chǎn)量的影響

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)克拉維酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on clavulanic acid yield

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度在25～37 ℃范圍內(nèi)的升高，克拉維酸產(chǎn)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵溫度28～32℃范圍內(nèi)克拉維酸產(chǎn)量較高，可能是菌體合成克拉維酸相關(guān)酶在該溫度內(nèi)活性較高；發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，克拉維酸產(chǎn)量達(dá)到最高，為4.10 g/L；當(dāng)發(fā)酵溫度高于32 ℃，克拉維酸產(chǎn)量持續(xù)降低，可能是克拉維酸合成受到抑制且降解增強(qiáng)的結(jié)果。故選擇發(fā)酵溫度28～32 ℃進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4.2 pH對(duì)克拉維酸產(chǎn)量的影響

圖4 pH值對(duì)克拉維酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of pH value on clavulanic acid yield

由圖4可知，隨著pH升高，克拉維酸產(chǎn)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH 6.5～7.5范圍內(nèi)克拉維酸產(chǎn)量較高，可能是克拉維酸合成增加且降解被抑制的結(jié)果；pH為7時(shí)克拉維酸產(chǎn)量達(dá)到最大值，為3.41 g/L；當(dāng)pH＞7.5之后，克拉維酸產(chǎn)量持續(xù)降低，可能高pH時(shí)克拉維酸降解速率增大所致。故選擇pH 6.5～7.5進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)克拉維酸產(chǎn)量的影響

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)克拉維酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on clavulanic acid yield

由圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在60～120 h范圍內(nèi)延長(zhǎng)，克拉維酸產(chǎn)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在發(fā)酵時(shí)間72～96 h范圍內(nèi)克拉維酸產(chǎn)量較高，可能是發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)相對(duì)充足且代謝副產(chǎn)物較少的結(jié)果；發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)克拉維酸產(chǎn)量達(dá)到最大值，為4.72 g/L；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞72 h之后，克拉維酸產(chǎn)量持續(xù)降低，可能與發(fā)酵液中代謝副產(chǎn)物增多有關(guān)。故選擇72～96 h進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4.4 突變株發(fā)酵條件優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇克拉維酸產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，發(fā)酵溫度（A）、pH值（B）及發(fā)酵時(shí)間（C）為考察因素進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，回歸模型顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表2。

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y=5.26+0.10A+0.39B-0.28C+0.025AB+0.065AC+0.11BC-0.21A2-0.77B2-0.10C2

根據(jù)表2可知，整體數(shù)學(xué)模型P＜0.000 1，失擬項(xiàng)P＞0.05，表明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合性好，可以用該模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)克拉維酸發(fā)酵工藝。方差分析結(jié)果顯示模型中A、B、C、BC、A2、B2、C2差異顯著，表明各因素對(duì)克拉維酸產(chǎn)量的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。根據(jù)回歸分析結(jié)果做圖得響應(yīng)曲面圖6。

表1 突變株發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Design and results of response surface methodology for fermentation conditions optimization of the mutant strain

表2 回歸模型方差分析Table 2 Variance analysis of the regression model

圖6 發(fā)酵溫度、pH值、發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)克拉維酸產(chǎn)量影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation temperature,pH and fermentation time on clavulanic acid yield

由圖6可知，克拉維酸產(chǎn)量隨pH值的增加變化幅度較大，發(fā)酵時(shí)間次之，發(fā)酵溫度影響較小，且pH值與發(fā)酵時(shí)間交互作用顯著。綜合上述分析結(jié)果，軟件Design-Export8.0.6確定的最佳提取工藝條件為發(fā)酵溫度28.94 ℃，pH值7.02，發(fā)酵時(shí)間73.32 h，克拉維酸產(chǎn)量理論值達(dá)到5.46 g/L。實(shí)際操作過(guò)程中將發(fā)酵條件修正為發(fā)酵溫度29℃，pH值7，發(fā)酵時(shí)間73 h，平行3次試驗(yàn)，克拉維酸產(chǎn)量實(shí)際值為5.44 g/L，絕對(duì)誤差為0.36%，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果與理論預(yù)測(cè)契合度良好。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在工業(yè)菌株棒狀鏈霉菌F613-1基礎(chǔ)上獲得一株高產(chǎn)菌，克拉維酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高19.9%；添加1.5%甘油和0.15%谷氨酸可大縮短低突變株發(fā)酵時(shí)間；突變株前36 h時(shí)25 ℃培養(yǎng)，后37 h時(shí)29 ℃培養(yǎng)，發(fā)酵pH值為7，克拉維酸產(chǎn)量達(dá)5.44 g/L，較出發(fā)菌株F613-1提高了55.8%。為下一步優(yōu)化發(fā)酵罐生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。