李小軍/河南省濟源市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 454650

1 大腸埃希菌

大腸埃希菌屬于革蘭陰性菌，具體形態(tài)為兩端呈現(xiàn)鈍圓的狀態(tài)，并且沒有芽孢存在的，大小上也偏小，并且存在著鞭毛，可以進行運動的，有單獨存在的，也有兩個一起存在的。腸道的正常菌群的組成部分之一就是非致病性的大腸埃希菌，所以它是沒有什么危害的，但是致病性大腸埃希菌則不同，如果感染了這種致病性的大腸埃希菌，輕微的癥狀可能會出現(xiàn)腹瀉，敗血癥，如果情況較為嚴(yán)重的話就會導(dǎo)致器官衰竭乃至死亡。

致病性的大腸埃希菌主要分為腸產(chǎn)毒素型大腸埃希菌、腸致病型大腸埃希菌、腸侵襲型大腸埃希菌、彌散黏附型大腸埃希菌、腸出血型大腸埃希菌、腸聚集型大腸埃希菌共六種類型，在這些類型中造成犢牛產(chǎn)生腹瀉或者是脫水死亡的最主要的病菌類型就是腸產(chǎn)毒素型大腸埃希菌。犢牛的大腸桿菌疾病還叫做犢牛白痢，這種疾病主要是在犢牛出生后的2d 左右會發(fā)病，并且死亡率是相當(dāng)高的，即使痊愈來也會有很多的后遺癥出現(xiàn)，有極大的可能性會影響到犢牛的生長發(fā)育。一些初期的臨床癥狀主要為排便呈現(xiàn)較稀的黃白色狀態(tài)，后期可能會夾雜一些血絲，體溫呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，如果是相對較為急性的病例的臨床表現(xiàn)主要為脫水較為嚴(yán)重，時間長了會出現(xiàn)敗血癥，嚴(yán)重的可能會出現(xiàn)器官衰竭的情況，可能不到一周就會死亡。通過解剖患病死亡的犢牛，可以看到病牛體內(nèi)的腸系膜淋巴結(jié)是腫的狀態(tài)，并且小腸的粘膜呈現(xiàn)出一種充血的狀態(tài)，肝臟以及腎臟相對正常的犢牛來看更加的蒼白，通過對這些患病器官進行分離鑒定以及藥敏實驗，選擇適合犢牛使用并且能夠達到最好的治療效果的藥物，為治療腹瀉犢牛大腸埃希菌提供有價值的參考。

2 實驗材料與實驗方法

2.1 實驗材料實驗材料的來源主要是解剖并取出患病死亡犢牛的內(nèi)臟器官，用于實驗的動物可以選用雄性的小白鼠來進行試驗。選擇普通肉湯、普通瓊脂平板等作為培養(yǎng)基，選擇革蘭染色液、MR 試劑、明膠溶液等作為主要試劑，還要選擇一些實驗所需要的藥敏片以及試劑盒。儀器上需要高速冷凍離心機、立式壓力蒸汽滅菌器、凝膠成像分析系統(tǒng)以及一個電子天平。

2.2 實驗方法首先進行病毒檢測，檢測牛病毒性腹瀉病毒、牛腺病毒7 型、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒這四種引起犢牛腹瀉的最常見的病毒類型。在犢牛的器官中選取肝與脾進行研磨勻漿離心，再分別按照病毒的DNA 和RNA 分別進行核酸樣品的提取。選取一定量的瓊脂糖平板凝膠來對 PCR結(jié)果進行電泳檢測。如果得到的結(jié)果呈現(xiàn)出陰性，就可以進行細菌分離鑒定。

進行細菌的分離鑒定前必須要對細菌進行分離培養(yǎng)，將已經(jīng)準(zhǔn)備好的犢牛的肝與脾分別進行劃線并且把它們接種在血平板的上面，進行恒溫的培養(yǎng)，1d 后在上面尋找一些疑似的菌落，分離在血平板的上面用劃線的方法，再進行單獨的恒溫培養(yǎng)，一定的時間后進行單獨的提取，然后進行形態(tài)結(jié)構(gòu)以及染色體的特性上的具體觀察。

分離出來的菌落要進行培養(yǎng)并且觀察，可以接種在普通的肉湯、普通平板和一些其他的平板以及一些瓊脂上進行分別的恒溫定時培養(yǎng)，到時間后分別觀察它們的具體狀態(tài)。

還要對已經(jīng)被分離出來的菌落進行生化試驗，比如接觸酶試驗或者是明膠試驗等很多種試驗方法，可以根據(jù)具體的菌落情況進行具體的選擇。

對分離出來的菌株也要進行基因序列檢測，查看擴增體系以及循環(huán)條帶，如果接種于瓊脂糖凝膠進行了電泳以后呈現(xiàn)出來的基因有陽性的條帶，那要進一步進行基因序列檢測，并且要將其與基因數(shù)據(jù)庫中的基因進行進一步的比對。

采用紙片擴散法來作為已經(jīng)分離出來的菌落的藥敏試驗。

選擇一些小鼠隨機打亂分組來進行分離菌的致病性試驗，向已經(jīng)分好組的小鼠分別注射已經(jīng)分離出的等量的不同的菌液，再抽取一組只注射無菌肉湯為對照組，然后對其出現(xiàn)的癥狀以及死亡率進行觀察以及記錄。

3 陽性結(jié)果判斷

3.1 病毒檢測對上述的四種常見的會引起腹瀉的四種病毒分別進行檢測，如果檢測的結(jié)果是陰性的，說明犢牛腹瀉疾病與這四種病毒無關(guān)。

3.2 培養(yǎng)分離出的菌落并且觀察革蘭染色體分別從犢牛的肝臟以及脾臟中分離出一株細菌，再挑取菌落，然后進行革蘭染色試驗，并觀察試驗的結(jié)果，一般正常情況下觀察到的實驗結(jié)果是革蘭染色呈現(xiàn)陰性的桿菌，大小較為中等，兩端的形態(tài)呈現(xiàn)鈍圓形態(tài)，單獨或者兩兩排列。

3.3 分離出來的菌落的特性分離出來的菌落在培養(yǎng)基中呈現(xiàn)出渾濁的狀態(tài)但是在瓊脂上的狀態(tài)卻各不相同，例如營養(yǎng)瓊脂中狀態(tài)極好，呈現(xiàn)灰白色的狀態(tài)，在SS 瓊脂上基本上不生長。

3.4 分離出的菌落的生化鑒定分別對分離出的菌落進行生化試驗，并且與大腸埃希菌進行了結(jié)果以及形態(tài)上的比對，試驗結(jié)果一致，可判定為大腸埃希菌。

3.5 基因檢測分別對分離出的菌落進行了DNA 基因檢測，并且與大腸埃希菌的基因序列進行比對，序列結(jié)果顯示一致，所以判定為大腸埃希菌。

3.6 進行藥敏試驗分別對分離出的菌落進行藥敏試驗，檢測其對抗生素藥物的敏感程度。

3.7 對于動物的致病性檢測分別采用小鼠作為試驗的對象，用于試驗的小鼠1d 內(nèi)的不同時間段均出現(xiàn)臨床反應(yīng)比如精神不振并且顫抖等，最后都死亡。對照組則一切良好。對死亡的小鼠進行解剖觀察可以發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的細菌與之前實驗所分離出的菌落是一致的。

4 結(jié)語

犢牛的腹瀉疾病無論是對于養(yǎng)牛場還是對于犢牛自身來說都是非常重要的，能否正確處理解決犢牛身上所發(fā)生的由于大腸埃希菌引起的腹瀉疾病，決定了犢牛以后的生長發(fā)育情況，從而也決定了養(yǎng)牛場能夠獲得什么樣的經(jīng)濟效益。關(guān)于大腸埃希菌的問題很多，細節(jié)復(fù)雜，治療難度也是一方面的挑戰(zhàn)，讓犢牛生活在干凈舒適的生活環(huán)境里也是不可忽視的一方面，從而減少細菌的入侵，嚴(yán)格記錄犢牛的身體狀況，發(fā)現(xiàn)問題迅速進行科學(xué)處理，不要拖延使問題擴大，從而影響到牛場的經(jīng)濟利益。本文通過對腹瀉犢牛大腸埃希菌的分離鑒定及藥敏試驗進行了具體分析以及探討，希望可以為養(yǎng)牛業(yè)提供一個參考，為從根本上解決犢牛腹瀉疾病問題，并進行一個科學(xué)合理的防治，從而來保證養(yǎng)牛業(yè)以及與犢牛相關(guān)的產(chǎn)業(yè)鏈能夠繼續(xù)保持穩(wěn)定發(fā)展的勢頭，繼續(xù)為我國經(jīng)濟發(fā)展貢獻一部分力量。