王冰 趙樂(lè) 余晶晶 蔡君蘭 丁美宙 彭斌 趙俊偉 趙曉東 秦亞瓊 劉克建 劉紹鋒 謝復(fù)煒

摘 要：為快速測(cè)定煙葉新植二烯含量，構(gòu)建了5 m DB-5ms預(yù)分離柱結(jié)合10 m DB-5ms分析柱的反吹柱系統(tǒng)，確立了反吹壓力103 kPa，反吹時(shí)間4.5 min的色譜條件及采用10 mL二氯甲烷渦旋提取0.5 g煙粉5 min的前處理方法，并對(duì)114個(gè)國(guó)內(nèi)外代表性煙樣進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：①新植二烯在10～200 μg/mL范圍內(nèi)線性良好（相關(guān)系數(shù)r?0.999 9）。新植二烯定量限為16 μg/g，加標(biāo)回收率在98%～101%之間，日間、日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.81%和1.76%，長(zhǎng)期（兩年）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。每個(gè)樣品分析時(shí)間僅為8 min。②將國(guó)內(nèi)5個(gè)生態(tài)區(qū)煙葉與代表性進(jìn)口煙葉中新植二烯含量進(jìn)行對(duì)比分析，西南高原生態(tài)區(qū)煙葉與代表性進(jìn)口煙葉無(wú)顯著性差異;其余4個(gè)生態(tài)區(qū)（武陵秦巴、南嶺丘陵、武夷丘陵、沂蒙丘陵）煙葉與代表性進(jìn)口煙葉有顯著性差異。③無(wú)論從整體還是從每個(gè)生態(tài)區(qū)分析煙葉新植二烯含量，上部煙葉與中部煙葉無(wú)顯著性差異，與下部煙葉相比，均有顯著性差異，下部煙葉新植二烯含量較高。本研究通過(guò)反吹氣相色譜-火焰離子化檢測(cè)器檢測(cè)煙葉新植二烯含量，所建方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于不同產(chǎn)區(qū)、不同部位煙葉中新植二烯含量的批量定量檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：煙葉;新植二烯;反吹技術(shù);氣相色譜

Abstract： In order to rapidly analyze neophytadiene in tobacco leaves， a back blowing column system （5 m DB-5ms pre separation column combined with 10 m DB-5ms analysis column） was developed. Chromatographic conditions （back blowing pressure of 103 kPa and back blowing time of 4.5 min） and pretreatment method （extracting 0.5 g tobacco powder with 10 mL dichloromethane vortexing for 5 min） were established， 114 representative tobacco samples at home and abroad were analyzed. The results showed that： 1） In a range of 10-200 μg/mL， neophytadiene had good linear relationship （r?0.999 9）. The limit of quantitation of neophytadiene was 16 μg/g. The spiked recoveries ranged from 98% to 101%， the relative standard deviations （RSD） of inter day and intra day were 1.8% and 1.76% respectively and the long-term （Two-year） RSD was less than 5%. The analysis time of each sample was only 8 min; 2） The contents of neophytadiene in tobacco leaves from five domestic ecological regions and abroad were compared， and no significant differences were found between the southwest plateau ecological region and abroad， but significant differences were observed between the other four domestic ecological regions （Wuling Qinba， Nanling hills， Wuyi hills， Yimeng hills） and abroad; 3） By analyzing the neophytadiene in tobacco leaves from the whole or each individual ecological region， no significant differences were found between the upper and middle leaves， but when compared with the lower leaves， there were significant differences and the content of neophytadiene in the lower leaves was higher. In this study， neophytadiene in tobacco leaves was detected by back blowing gas chromatography and flame photometric detector. The method was simple， rapid， sensitive and reproducible. It can be used for batch quantitative determination of neophytadiene in different parts of tobacco leaves from different production regions.

Keywords： tobacco; neophytadiene; back-flush technique; gas chromatography

新植二烯屬葉綠素降解產(chǎn)物，是烤煙中含量最高的中性致香成分，占煙葉鮮重的0.06%～0.1%，可作為煙氣氣溶膠內(nèi)香氣物質(zhì)的載體，具有攜帶煙葉中致香成分進(jìn)入煙氣的能力，是煙葉重要的增香劑[1-2]。在煙草燃燒時(shí)，新植二烯可直接進(jìn)入煙氣，具有減輕刺激性，醇和煙氣的作用，其含量與煙氣柔和性顯著正相關(guān)[3];而且可進(jìn)一步分解轉(zhuǎn)化為植物呋喃，能顯著增加烤煙的香氣和吃味，對(duì)煙葉質(zhì)量、香氣風(fēng)格有重大影響，是影響卷煙感官質(zhì)量的主要影響因子之一[4]。

目前對(duì)于煙草中新植二烯的檢測(cè)方法，除楊盼盼等[5]報(bào)道的近紅外法快速測(cè)定初烤煙葉中新植二烯含量，其他大都是與煙草微量香味成分共同分析，存在前處理方法操作繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力，上機(jī)時(shí)間較長(zhǎng)等缺陷，且大都采用相對(duì)定量方式[6-14]。關(guān)于煙草中新植二烯準(zhǔn)確定量檢測(cè)方法的系統(tǒng)研究鮮有報(bào)道，尚未形成統(tǒng)一、規(guī)范化的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。

本文采用有機(jī)溶劑提取煙葉中新植二烯，對(duì)提取體系、提取溶劑和提取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化;結(jié)合氣相色譜反吹技術(shù)[15-18]采用火焰離子化檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，以期提高檢測(cè)效率，為煙葉原料篩選提供技術(shù)支持和準(zhǔn)確數(shù)據(jù)保證。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑與材料

二氯甲烷（色譜純，美國(guó)Acros Organics公司）;正十七烷（純度大于98%，百靈威公司）;新植二烯（純度均>80.0%，加拿大TRC公司）。根據(jù)全國(guó)烤煙煙葉香型風(fēng)格區(qū)劃[19]研究結(jié)果，收集國(guó)內(nèi)西南高原、武陵秦巴、南嶺丘陵、武夷丘陵、沂蒙丘陵五大生態(tài)區(qū)上、中、下3個(gè)部位煙樣99個(gè)及巴西、津巴布韋、美國(guó)代表性煙葉11個(gè)，所選煙葉樣品均為2018年煙葉樣本。

1.2 設(shè)備

6890A氣相色譜儀[配有氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）和壓力控制模塊（PCM），美國(guó) Agilent Technologie]、SRL-3.7MB5C無(wú)油式螺桿空壓機(jī)（南京日立產(chǎn)機(jī)有限公司）、450cc氫氣發(fā)生器（英國(guó)PEAK）、精密電子天平（感量0.0001 g，德國(guó)Sartorius）、數(shù)顯型旋渦混合器（美國(guó)TALBOYS Advanced Multi-Tube Vortexer）、LC-223鼓風(fēng)干燥箱（上海愛(ài)斯佩克環(huán)境設(shè)備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 煙葉晾干后粉碎，過(guò)40目篩，室溫裝于封口袋中備用。按照YC/T 31—1996行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)煙樣含水率。稱取0.5 g煙粉于50 mL離心管，加入50 μL正十七烷內(nèi)標(biāo)溶液（內(nèi)標(biāo)物濃度為10 mg/mL）及10 mL二氯甲烷溶液，2500 r/min條件下渦旋提取5 min，10 000 r/min下離心3 min，取上清液過(guò)2 μm有機(jī)相濾膜于一1.5 mL色譜瓶中，等待BF-GC-FID分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制 稱取0.1 g正十七烷于10 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容，配成內(nèi)標(biāo)溶液。

將10 mg新植二烯溶于10 mL容量瓶中并用二氯甲烷定容，配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取100、200、500 μL，1、2 mL儲(chǔ)備液于5個(gè)10 mL容量瓶中，并分別加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液，配制成5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，標(biāo)線濃度范圍為10～200 μg/mL，內(nèi)標(biāo)濃度為50 μg/mL。

1.3.3 反吹氣相色譜質(zhì)譜條件 色譜柱1：DB-5ms （5 m×0.25 mm，0.25 μm）;色譜柱2：DB-5ms（10 m×0.25 mm，0.25 μm）。載氣：N2;進(jìn)樣口溫度：280 ℃;進(jìn)樣量：1 μL;分流比為20∶1。進(jìn)樣口壓力：131 kPa（保持4.5 min），然后以683 kPa/min速率降至34 kPa（保持3.5 min）。PCM壓力：103 kPa。升溫程序：初溫100 ℃，以20 ℃/min的升溫速度升到200 ℃，再以90 ℃/min的升溫速率升至290 ℃，保持3 min。FID參數(shù)：溫度300 ℃，氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min，尾吹流量25 mL/min。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 樣品數(shù)據(jù)為扣除水分后以干質(zhì)量計(jì)含量。運(yùn)用Excel 2010對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，運(yùn)用SPSS Statistics 17.0對(duì)樣品新植二烯含量進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 反吹裝置介紹

反吹裝置如圖1所示，預(yù)柱、分析柱及PCM（壓力控制模塊）通過(guò)微流控三通相連。當(dāng)進(jìn)樣口壓力大于PCM壓力時(shí)，載氣流路如圖1A所示，化合物通過(guò)預(yù)柱及分析柱，進(jìn)入FID檢測(cè)器。當(dāng)進(jìn)行反吹時(shí)（圖1B），PCM壓力大于進(jìn)樣口壓力，目標(biāo)化合物通過(guò)預(yù)柱、分析柱后進(jìn)入FID，而不需要分析的化合物在載氣的帶動(dòng)下，通過(guò)預(yù)柱，從進(jìn)樣口反吹出去;通過(guò)反吹，在新植二烯后出峰的物質(zhì)均被吹出，不再進(jìn)入分析柱及檢測(cè)器。

2.2 氣相色譜條件優(yōu)化

2.2.1 無(wú)反吹時(shí)樣品分離效果 采用色譜柱1（DB-5ms：5 m×0.25 mm，0.25 μm）為預(yù)柱，色譜柱2（DB-5ms：10 m×0.25 mm，0.25 μm）為分析柱進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，通過(guò)安捷倫Mass Hunter工作站自帶的壓力流量計(jì)算器計(jì)算可得，當(dāng)進(jìn)樣口壓力為131 kPa，PCM壓力為103 kPa，爐溫在100～200 ℃時(shí)（根據(jù)文獻(xiàn)[5]可知，新植二烯大約在200 ℃出峰），預(yù)柱與分析柱流量均為2～3 mL/min，可以實(shí)現(xiàn)快速分析新植二烯的預(yù)想。因此，設(shè)定進(jìn)樣口壓力為131 kPa，PCM壓力為103 kPa，采用1.3.3中的程序升溫條件，進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果（圖2）表明，該系統(tǒng)下可實(shí)現(xiàn)樣品中新植二烯的基線分離;但柱系統(tǒng)中有大量雜質(zhì)，需要高溫烘烤才能潔凈分析系統(tǒng)，以進(jìn)行后續(xù)分析工作。

為了提高分析效率，可采用反吹技術(shù)。該技術(shù)的使用不僅可潔凈分析系統(tǒng)，增加其穩(wěn)定性，延長(zhǎng)分析柱壽命，而且可節(jié)約分析時(shí)間，提高分析效率。

2.2.2 反吹時(shí)間優(yōu)化 由預(yù)試驗(yàn)結(jié)果可知，不反吹時(shí)新植二烯出峰時(shí)間約為5.2 min，因此，分別將反吹時(shí)間設(shè)為3、4、4.5、5 min，即當(dāng)分析時(shí)間為3、4、4.5、5 min時(shí)，將進(jìn)樣口壓力由131 kPa迅速調(diào)至34 kPa，PCM壓力仍為103 kPa。通過(guò)安捷倫MassHunter工作站自帶的壓力流量計(jì)算器計(jì)算可得，預(yù)柱流量約為6 mL/min，分析柱流量約為2 mL/min，此時(shí)，既實(shí)現(xiàn)了快速反吹，又使分析柱保持了預(yù)期流速。將預(yù)試驗(yàn)中進(jìn)入分析柱的化合物通過(guò)反向吹掃，使之從進(jìn)樣口出口快速吹出，不再進(jìn)入分析柱及檢測(cè)器，吹掃時(shí)間3.5 min。試驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，3 min反吹，內(nèi)標(biāo)尚未進(jìn)入分析柱;4 min反吹，新植二烯尚未進(jìn)入分析柱;4.5 min反吹，內(nèi)標(biāo)與新植二烯均進(jìn)入分析柱，且達(dá)到基線分離;5 min反吹，已有雜質(zhì)進(jìn)入分析柱。因此，選擇4.5 min為反吹時(shí)間。整個(gè)分析過(guò)程8 min即可完成。

2.3 前處理方法優(yōu)化

2.3.1 提取體系選擇 采取直接提取和泡發(fā)提取兩種體系進(jìn)行試驗(yàn)：①以二氯甲烷10 mL提取0.5 g干煙粉;②稱取0.5 g干煙粉，加入1 mL蒸餾水泡發(fā)10 min，以二氯甲烷10 mL進(jìn)行提取。每組試驗(yàn)平行3次。試驗(yàn)結(jié)果表明（圖4），采用二氯甲烷對(duì)干煙粉中新植二烯的提取量比對(duì)泡發(fā)后煙葉的提取量高約15%。

2.3.2 提取溶劑選擇 考察了二氯甲烷、正己烷、甲基叔丁基醚3種溶劑的提取效果，每種溶劑平行試驗(yàn)3次。結(jié)果表明（圖5），二氯甲烷的提取效果最好，新植二烯含量為1.20 mg/g，甲基叔丁基醚的提取效果最差，新植二烯含量為1.06 mg/g。

新植二烯學(xué)名為3-亞甲基-7，11，15-三甲基十六碳烯，是含有3個(gè)甲基、1個(gè)亞甲基的長(zhǎng)鏈烯烴。由此可知，該物質(zhì)具有弱極性，根據(jù)相似相容原理，具有弱極性的二氯甲烷比無(wú)極性的正己烷對(duì)新植二烯具有更高的提取效率，而甲基叔丁基醚的提取效率最低可能是由于其空間位阻所致。

2.3.3 提取料液比選擇 分別用10 mL二氯甲烷提取0.2、0.5、1.0、2.0 g煙粉，每個(gè)稱樣量平行試驗(yàn)3次。結(jié)果表明（圖6），用10 mL二氯甲烷提取0.2、0.5、1.0 g煙粉時(shí)，新植二烯提取完全，計(jì)算結(jié)果均為1.20 mg/g，用10 mL二氯甲烷提取2.0 g煙粉時(shí)，計(jì)算結(jié)果為1.18 mg/g，略有降低。因此當(dāng)用10 mL二氯甲烷提取煙葉中的新植二烯時(shí)，選取0.5 g為煙粉的稱樣量，此時(shí)可保證提取完全。

2.3.4 提取時(shí)間優(yōu)化 考察了提取5、10、15、20、25 min時(shí)新植二烯的提取效果，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行試驗(yàn)3次。結(jié)果表明（圖7），提取時(shí)間分別為5、10、15、20、25 min時(shí)，用10 mL二氯甲烷提取0.5 g干煙粉，煙粉中新植二烯的提取量是一致的，并沒(méi)有隨著提取時(shí)間的增加而增加，說(shuō)明5 min即可完成對(duì)新植二烯的提取。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限 將配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行BF-GC-FID分析，采用內(nèi)標(biāo)法定量。以新植二烯與內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)面積比為縱坐標(biāo)，濃度比為橫坐標(biāo)作圖（圖8），得到新植二烯的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。將最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣10次，分別以測(cè)定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍和10 倍確定方法的檢出限和定量限。結(jié)果顯示，新植二烯的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性關(guān)系良好（濃度范圍為10～200 μg/mL），相關(guān)系數(shù)平方為1;檢測(cè)限、定量限分別為4.90 μg/g、16.00 μg/g，遠(yuǎn)低于煙葉提取液中新植二烯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，滿足對(duì)煙葉中新植二烯分析的檢測(cè)要求。

2.4.2 精密度及回收率 選取典型烤煙樣品，連續(xù)5 d進(jìn)行試驗(yàn)以考察方法日間精密度;同一天內(nèi)，以相同前處理方法進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，以考察方法日內(nèi)精密度。以實(shí)際樣品含量為參考，根據(jù)新植二烯在煙末中含量的0.5、1、2倍進(jìn)行低、中、高加標(biāo)回收率試驗(yàn)。結(jié)果表明，方法日間、日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.81%和1.76%，新植二烯回收率在98%～102%。采用該方法，歷時(shí)兩年多，進(jìn)行了2000余個(gè)煙樣中新植二烯含量的分析，監(jiān)控?zé)煒酉鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。

2.5 樣品分析

2.5.1 不同產(chǎn)地?zé)熑~新植二烯含量分析 采用所建立的方法對(duì)武陵秦巴、南嶺丘陵、武夷丘陵、沂蒙丘陵、西南高原五大生態(tài)區(qū)上（B2F）、中（C3F）、下（X2F）3個(gè)部位99個(gè)煙樣及11個(gè)代表性進(jìn)口煙葉新植二烯含量進(jìn)行分析。測(cè)定結(jié)果（表1、圖9）表明：①所有煙樣可分為2組：西南高原生態(tài)區(qū)煙葉與代表性進(jìn)口煙葉為一組，其新植二烯含量沒(méi)有顯著性差異（p=0.211），均值分別為0.83、0.79 mg/g，變異系數(shù)分別為17.44%、17.82%。武陵秦巴、南嶺丘陵、武夷丘陵、沂蒙丘陵4個(gè)生態(tài)區(qū)煙葉為一組，其新植二烯含量無(wú)顯著性差異（p = 0.472），均值含量分別為1.00、1.08、0.97、1.03 mg/g，變異系數(shù)分別為18.48%、15.08%、12.94%、12.85%。②兩組煙樣間新植二烯含量有顯著性差異（p<0.001）。西南高原生態(tài)區(qū)煙葉與代表性進(jìn)口煙葉新植二烯含量均值為0.81 mg/g，其余4個(gè)生態(tài)區(qū)煙葉新植二烯含量均值為1.02 mg/g，前者比后者低約21%。

2.5.2 不同部位煙葉新植二烯差異分析 對(duì)武陵秦巴、南嶺丘陵、武夷丘陵、沂蒙丘陵、西南高原五大生態(tài)區(qū)上（B2F）、中（C3F）、下（X2F）3個(gè)部位99個(gè)煙樣新植二烯含量進(jìn)行分析。結(jié)果（表2、圖10、圖11）表明，①總體來(lái)看，上部煙葉與中部煙葉新植二烯含量無(wú)顯著性差異（p=0.125）;上部煙葉、中部煙葉與下部煙葉相比均有顯著性差異（p<0.001）。上、中、下3個(gè)部位新植二烯均值含量分別為0.88、0.93、1.13 mg/g，變異系數(shù)分別為16.12%、14.30%、13.60%。下部煙葉新植二烯含量均值較高，與上部、中部煙葉相比，新植二烯含量約高25%。②每個(gè)生態(tài)區(qū)上、中、下3個(gè)部位煙葉新植二烯含量分析結(jié)果與總體煙樣分析結(jié)果趨勢(shì)相同，上部煙葉與中部煙葉新植二烯含量無(wú)顯著性差異，與下部煙葉相比，均有顯著性差異，下部煙葉新植二烯含量較高。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)前處理?xiàng)l件及氣相色譜條件的優(yōu)化，建立了采用10 mL二氯甲烷渦旋提取0.5 g煙粉5 min的前處理方法，構(gòu)建了5 m DB-5ms預(yù)分離柱結(jié)合10 m DB-5ms分析柱的反吹柱系統(tǒng)，確立了103 kPa為反吹壓力，4.5 min為反吹時(shí)間的分析條件。樣品分析表明，國(guó)內(nèi)五大生態(tài)區(qū)煙葉與代表性進(jìn)口煙葉相比，僅西南高原生態(tài)區(qū)煙葉與代表性進(jìn)口煙葉新植二烯含量較為接近;上、中、下3個(gè)部位煙葉相比，上部、中部煙葉新植二烯含量顯著低于下部煙葉。本研究建立的煙葉新植二烯檢測(cè)方法，前處理簡(jiǎn)單、定量準(zhǔn)確、重復(fù)性好，適合大量煙樣中新植二烯定量分析，為煙葉原料篩選、煙葉生態(tài)環(huán)境及加工工藝條件研究提供了技術(shù)支持。

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