武盼盼，劉書武，張曉寧

(1.河南省化工研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450052 ； 2.云南省煙草公司 文山州公司，云南 文山 663000 ； 3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 曲周試驗(yàn)站，河北 邯鄲 057250)

0 引言

煙草生長發(fā)育必需的元素有19種，其中煙草需要量較大有的氮、磷、鉀等10種元素，需要的微量元素有硼、鎂等9種。必需的元素對煙草生長發(fā)育非常重要，影響著煙草的生長發(fā)育和產(chǎn)量[1]。但近年來隨著集約化農(nóng)業(yè)的發(fā)展和推廣應(yīng)用，依靠著農(nóng)業(yè)機(jī)械化的推進(jìn)、復(fù)種指數(shù)的增加、長期無機(jī)肥料和化學(xué)農(nóng)藥的大量投入及有機(jī)肥比例的急劇減少，雖然大幅提高了煙草的產(chǎn)量，但對土壤中營養(yǎng)元素的消耗量也逐年增加，土壤可持續(xù)性在不斷下降。逐漸出現(xiàn)大量元素的富營養(yǎng)化，中、微量元素補(bǔ)充不足的問題。

前期的土壤普查檢測發(fā)現(xiàn)，土壤缺乏硼、鎂等中微元素且日益突出。鎂是煙草生長發(fā)育的一種必需元素，作為酶、葉綠素等成分在植物體內(nèi)存在，并參與在逆境條件脅迫下的植物信號傳導(dǎo)[2]。植物缺鎂的主要癥狀就是失綠黃化，一旦缺鎂，就會(huì)破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，損傷被膜，降低基粒數(shù)和類囊體數(shù)目，減弱植物葉片進(jìn)行光合作用的能力[3]。劉厚誠等[4]認(rèn)為缺鎂會(huì)比較明顯影響到植物的光合作用，主要表現(xiàn)在葉片的光飽和點(diǎn)、光補(bǔ)償點(diǎn)降低，會(huì)明顯降低飽和光強(qiáng)下的最大凈光合速率。在植物體中，還參與光合作用、呼吸作用、糖酵解、三梭酸循環(huán)等過程，是這些過程中一些相關(guān)酶的活化劑。鎂對煙灰的凝結(jié)性、卷煙的燃燒性和煙葉色澤均有良好的作用。周冀衡等[2]研究發(fā)現(xiàn)，鎂能協(xié)調(diào)煙草化學(xué)成分，提高可溶性糖的含量，降低煙堿與蛋白質(zhì)含量，減少刺激性等影響煙葉的品質(zhì)。硼是煙草必需的一種微量元素，主要參與糖代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)過程，能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長，促進(jìn)植物半纖維素、細(xì)胞壁的形成，對碳、氮和酚類代謝及木質(zhì)化作用有重要的調(diào)節(jié)作用，還能夠提高葉片的蒸騰速率和光合作用效率，促進(jìn)根系生長發(fā)育，提高煙株的抗逆性。韋翔華等[5]研究發(fā)現(xiàn)硼能夠顯著促進(jìn)煙草花粉粒的萌發(fā)和植物花粉管的生長。當(dāng)煙株缺硼時(shí)，就會(huì)抑制糖的合成，影響同化物的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而使煙株中積累大量的淀粉和糖分，嚴(yán)重影響煙葉的品質(zhì)[6]。

這些元素的缺乏成為制約丘北煙區(qū)烤煙產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。本實(shí)驗(yàn)以無機(jī)肥料的優(yōu)化配比對土壤酶活性、微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)及其代謝等主要生物學(xué)性狀的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地在云南省文山州丘北。海拔為1 465 m，年平均氣溫16.20 ℃，年降雨量1 174.2 mm，自然氣候優(yōu)越，立體氣候明顯，地勢平坦，灌溉方便。試驗(yàn)面積共0.13 hm2，前茬閑置，土壤類型為紅壤，質(zhì)地為中壤土，肥力均勻。供試品種為云煙87，在0～20 cm耕作層土壤養(yǎng)分含量和理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤的基本理化性狀

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置 4 個(gè)處理：處理CK1，煙農(nóng)施肥量；處理Y，煙農(nóng)優(yōu)化施肥；處理T1，推薦施肥1；處理T2，推薦施肥2。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，共12個(gè)小區(qū)，采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。每個(gè)小區(qū)種煙30株，株行距為55 cm×110 cm，小區(qū)四周均設(shè)保護(hù)行。試驗(yàn)區(qū)大田管理措施按文山州優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行。具體施肥量如表2所示。

表2 實(shí)驗(yàn)施肥量

1.3 樣品采集

分別于煙苗移栽后35、75、118天3個(gè)時(shí)期采用五點(diǎn)取樣法選采樣點(diǎn)，在各處理小區(qū)去除表層土后用抖土法采集根際土并混勻?qū)⑼寥罉悠贩殖?份，其中過2 mm篩的一份新鮮土樣裝入無菌袋中，用冰盒帶回并保存于4 ℃冰箱，用于土壤微生物數(shù)量及群落功能多樣性的分析；另一份土樣風(fēng)干，磨細(xì)過830 μm(20目)篩后用于測定土壤脲酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶。

1.4 測定項(xiàng)目和方法

1.4.1土壤酶活性

土壤過氧化氫采用高錳酸鉀氧化法；土壤蔗糖酶活性、土壤脲酶活性、土壤酸性磷酸酶活性測定參照文獻(xiàn)[7]。

1.4.2微生物數(shù)量和群落功能多樣性

細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量用稀釋平板法，細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、真菌用馬丁氏培養(yǎng)基、放線菌用高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)[8]。研究不同施肥處理對土壤微生物群落功能多樣性的影響用Biolog-ECO微平板法，具體操作步驟參照文獻(xiàn)[9]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用培養(yǎng)120 h的590 nm下的光密度值數(shù)據(jù)進(jìn)行土壤微生物碳源利用分析和主成分分析，平均每孔顏色變化率(AWCD)計(jì)算公式如(1)所示。

AWCD=∑[(Ai-A1)/31]

(1)

式中：Ai為第i個(gè)反應(yīng)孔的光密度值；A1是對照孔的光密度值。

功能多樣性指數(shù)：Shannon 指數(shù)(H)、Simpson指數(shù)(D)和McIntosh指數(shù)(U)，計(jì)算公式如(2)～(4)所示[15]。

H=-∑(PilnPi)

(2)

(3)

式中：Pi=(Ai-A1)/∑(Ai-A1)，表示第i孔的相對光密度值與整個(gè)微板相對光密度值總和的比值；N表示第i孔的相對光密度值(Ai-A1)。

采用Microsoft Excel 2010作圖表和SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 化肥優(yōu)化對烤煙根際微生物數(shù)量動(dòng)態(tài)變化

不同施肥處理根際土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量土壤微生物AWCD隨培養(yǎng)時(shí)間的變化見圖1。

CK：煙農(nóng)施肥；Y：煙農(nóng)優(yōu)化；T1：推薦1；T2：推薦2

從圖1的細(xì)菌數(shù)量上看，表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢且在移栽后75 d的時(shí)候達(dá)到了峰值。從3個(gè)時(shí)期與對照CK相比，推薦2的各個(gè)時(shí)期的微生物數(shù)量都比較高且與其他處理達(dá)到了顯著水平，T1大體上要優(yōu)于Y，其兩者細(xì)菌的數(shù)量都好于CK且在移栽后75 d達(dá)到了顯著水平。細(xì)菌數(shù)量大小的大致表現(xiàn)為T2(推薦2)>T1(推薦1)>Y(煙農(nóng)優(yōu)化)>CK(煙農(nóng)施肥)，表明T1與T2均能增加烤煙根際的細(xì)菌數(shù)量，Y的總體上比CK好但兩者未達(dá)到顯著水平。

從圖1的放線菌數(shù)量結(jié)果看出，各個(gè)時(shí)期各個(gè)處理土壤放線菌的數(shù)量都有差異，隨著煙草生育期的推進(jìn)，是先上升后下降的現(xiàn)象。在整個(gè)生育期內(nèi)，以T1、T2的根際放線菌數(shù)量較高，在移栽后75 d放線菌較CK提高量達(dá)到了峰值，丘北較CK分別提高139.5%、113.8%。Y處理在放線菌數(shù)量都要好于CK且達(dá)到顯著水平(P<0.05)。放線菌的數(shù)量總體趨勢是T2、T1>Y>CK，說明與CK相比，本實(shí)驗(yàn)的各個(gè)處理均能提高根際放線菌數(shù)量，總體以T1最佳。

由圖1的真菌數(shù)量上看，4個(gè)施肥處理均表現(xiàn)為在煙草移栽后75 d數(shù)量達(dá)到最大值后逐漸下降的趨勢。其中丘北的變化幅度比較大，丘北的T2各個(gè)時(shí)期的真菌數(shù)量都要少于各個(gè)處理且達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。

2.2 化肥優(yōu)化對烤煙根際微生物群落代謝功能多樣性的影響

2.2.1根際土壤微生物對碳源總的利用能力(AWCD)的變化

AWCD反映的是隨時(shí)間的變化微生物對碳源利用強(qiáng)度的變化，也是微生物碳源代謝活性的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，數(shù)值越大微生物的代謝活性越大。AWCD值是與土壤微生物群落中能利用單一碳源的微生物種類和數(shù)目密切相關(guān)的。由圖1可以看出，各個(gè)處理的AWCD值在24～48 h的變化比較平穩(wěn)，在96～120 h快速上升以后進(jìn)入一個(gè)相對均衡的上升過程，因此采用120 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析是比較能反應(yīng)微生物整體的活性的。在培養(yǎng)的192 h中，隨著煙草的生長發(fā)育，各處理的土壤微生物AWCD值逐漸升高，表明微生物的整體代謝活性逐漸增強(qiáng)。其中，推薦2處理的 AWCD值總體上在各個(gè)時(shí)期不同的地方均表現(xiàn)為最高。表明在煙草的生長過程中，推薦2處理會(huì)顯著提高微生物的代謝活性，增強(qiáng)其利用碳源的能力。而推薦1的AWCD 值在各個(gè)時(shí)期大致要略高于優(yōu)化處理且兩者都高于CK，說明3個(gè)處理均能不同程度地提高根際微生物的整體代謝活性和數(shù)量。

2.2.2化肥優(yōu)化施肥措施下根際土壤微生物對不同類型碳源利用的差異

微生物對不同碳源的利用能力可表征土壤微生物的代謝功能類群。Biolog-ECO微平板上含有31種碳源，根據(jù)官能團(tuán)不同將其分為6大類，采用120 h的AWCD值計(jì)算得到微生物對6大類碳源的相對利用率圖譜。由圖2可知，在煙草的整個(gè)生育期內(nèi)，各處理碳源利用種類有很大差別，與CK相比，各個(gè)施肥處理均不同程度增加了糖類碳源、氨基酸類碳源。在移栽后55 d，各施肥處理的微生物均增加了糖類碳源、氨基酸類碳源的相對利用率，降低了羧酸類碳源的相對利用率。微生物在碳源的利用上增加了多胺碳源的相對利用。在移栽后75 d，各施肥處理均顯著增加了微生物對糖類碳源、氨基酸類碳源、羧酸類碳源的相對利用率。在采烤結(jié)束后，各施肥處理均顯著增加了微生物對氨基酸類碳源、羧酸類碳源的相對利用率。

CH：糖類；AA：氨基酸類；CA：羧酸類；PM：聚合物類；AM：胺類；PA：酚酸類

2.3 化肥優(yōu)化對烤煙根際土壤酶活性的影響

由圖2可見，在煙草整個(gè)生育期內(nèi)不同施肥處理的脲酶活性變化類似都是逐漸增加的，在移栽后75 d達(dá)到峰值后開始下降。在煙草的整個(gè)生長發(fā)育時(shí)期3個(gè)施肥處理均要高于CK且達(dá)到顯著水平，酶活性的大小為T2>T1>Y，分別比CK最大增加為120.3%、88.3%、83.5%，說明3個(gè)施肥處理均能提高土壤的脲酶活性，而T2處理在提高土壤酶活性比其他的處理有更加明顯的效果。

由圖2可以看出，各個(gè)時(shí)期各個(gè)處理的蔗糖酶活性是呈上升的趨勢，其中3個(gè)處理在3次采樣中的蔗糖酶活性都要高于CK且達(dá)到了顯著水平。蔗糖酶活性大體上為T2>T1、Y>CK，T2、T1、Y處理比CK最大提高分別為51.2%、48.1%、98.7%，說明3個(gè)處理均能提高土壤蔗糖酶活性且T2增加的效應(yīng)更好。

磷酸酶主要來源于植物根系和土壤微生物的分泌物，對土壤中有機(jī)磷的水解有重要貢獻(xiàn)，其活性的高低甚至可以用作診斷植株磷素豐缺的指標(biāo)[10]。由圖2可得，在煙草的生育期內(nèi)各處理的土壤酸性磷酸酶活性變化的趨勢與脲酶類似都是先升高后下降。土壤酸性磷酸酶活性表現(xiàn)趨勢與蔗糖酶的表現(xiàn)趨勢大致相似，4個(gè)施肥處理在兩地的蔗糖酶活性總體上是T2>T1、Y>CK，其中與CK都達(dá)到了顯著性差異以T2處理的酸性磷酸酶活性最高，說明3個(gè)處理均能增強(qiáng)烤煙土壤酸性磷酸酶活性。

3 結(jié)果與討論

微生物群落在土壤中是處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，土壤理化因子的變化會(huì)影響其平衡，從而影響土壤微生物的活性及生態(tài)功能，進(jìn)而影響土壤肥力和環(huán)境質(zhì)量[11]。云南土壤的pH值偏酸性，化學(xué)肥料(主要是施氮、磷、鉀肥或氮、磷、鉀不同配比的復(fù)混肥)連年施用，許多研究表明，化肥的過量連續(xù)施用會(huì)降低土壤pH值，造成土壤酸化[12-13]。土壤的酸化導(dǎo)致土壤的碳氮比失衡及進(jìn)一步造成磷、硼、鈣、鎂等營養(yǎng)元素的缺失，造成養(yǎng)分失衡問題。對文山的土壤質(zhì)量進(jìn)行普查發(fā)現(xiàn)，土壤問題之一是土壤B、Mg等元素偏低。B、Mg是植物生長發(fā)育過程中必需元素，它們涉及植物幾乎全部的新陳代謝過程，如氮、磷和碳初級和次級代謝，酶系統(tǒng)的運(yùn)作等，葉綠素的合成、激素信號傳導(dǎo)、基因調(diào)節(jié)、細(xì)胞的自我保護(hù)都需要微量元素的參與[14-17]。缺乏時(shí)嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，這與土壤中缺乏相應(yīng)元素是密切相關(guān)的。土壤中這些元素含量對植物中這些元素含量有重要的直接影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同的化肥措施對煙草根際土壤微生物數(shù)量是不相同的，可以看出添加微量元素及補(bǔ)充P、K方面，推薦1的細(xì)菌、放線菌數(shù)量施肥處理要顯著高于煙農(nóng)施肥處理。其次對于只施了微量元素的Y處理細(xì)菌、放線菌數(shù)量也要好于煙農(nóng)施肥，說明中、微量元素的施入可以增加烤煙根際微生物的細(xì)菌、放線菌的數(shù)量。這可能是微量元素的加入增加了土壤養(yǎng)分，更能滿足微生物中某些種群的生長，另一方面也滿足植物對多種養(yǎng)分的需求，增加根的生物量使根際微生物的活動(dòng)范圍更加廣泛，促進(jìn)植物對養(yǎng)分的吸收，同時(shí)也提高了肥料利用率。減少氮肥、添加中、微量元素及調(diào)節(jié)肥料配比方法(推薦2)處理的效果最好，說明適當(dāng)減肥并調(diào)節(jié)基追比更能促進(jìn)細(xì)菌、放線菌的生長。在真菌的數(shù)量上4個(gè)處理有一些差異，總體上 CK>Y>T1、T2。這3類微生物數(shù)量上的表現(xiàn)與黃玉茜[18]的研究結(jié)果是比較相似的。在兩地的碳源利用情況可以看出，AWCD值的大小變化與細(xì)菌放線菌數(shù)量的變化比較一致，都是T2>T1>Y>CK。表明與煙農(nóng)施肥相比，推薦1、推薦2、煙農(nóng)優(yōu)化施肥都可以增加根際微生物的代謝活性。這與花東來等[19]研究的合理施肥可以提高微生物的代謝活性的結(jié)果相一致。與CK相比，3個(gè)處理均增加了在碳源的利用，在利用率上有比較大的差異，主要表現(xiàn)在對糖類碳源和氨基酸碳源的利用上。丘北的微生物對多胺類碳源出現(xiàn)了偏好。從總體的碳源利用率可以將其劃分為3類，一類是T2，一類是Y、T1，一類是CK。

在土壤酶活性上，可以看到3個(gè)處理的酶活性都要高于處理前，這與前人的研究結(jié)果是一致的[20-21]。無機(jī)肥料的施用上適當(dāng)添加一定量的中、微量元素，比單施氮磷鉀肥更有利于提高微生物數(shù)量、增加多樣性及土壤酶活性的。其中調(diào)配磷鉀比并適當(dāng)減肥增加基追比為5∶5的施肥處理效果最佳。丁效東等[22]發(fā)現(xiàn)在一定的氮水平下，追施比(5∶5)比基追比為7∶3時(shí)更吻合優(yōu)質(zhì)烤煙對氮需求規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之類似。鄭德劍等[23]研究中微量復(fù)合肥可以有效促進(jìn)葉綠素的合成增強(qiáng)光合作用，增強(qiáng)甘蔗抗逆性，病蟲害減少顯著增產(chǎn)的效果。因此在煙草生產(chǎn)上要根據(jù)當(dāng)?shù)胤柿η闆r在保證氮、磷、鉀大量元素施用的基礎(chǔ)上，補(bǔ)充一定量的微量元素，同時(shí)減少氮肥用量，調(diào)節(jié)基追比，可以更好地調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境。