姜林宏, 張鶴達(dá), 鐘山亮, 唐金海

胃癌是世界上大多數(shù)地區(qū)的一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題[1-3],給世界各地帶來了巨大的健康負(fù)擔(dān),尤其在中國(guó)[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì),2018年全球約有1 033 701例胃癌新發(fā)患者和782 685例胃癌死亡患者,在所有癌癥中,胃癌的發(fā)病率和死亡率分別排在第五位和第三位[5]。目前盡管手術(shù)和輔助治療方法都有所改進(jìn),但胃癌患者的臨床治療效果仍然很差,研究顯示胃癌患者的5年總生存率一般低于30%[4],因此有必要進(jìn)一步探索胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,提供更積極、有效的治療新思路。

環(huán)狀RNA是一類結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、組織特異性高的內(nèi)源性RNA,它們將兩個(gè)堿性末端以共價(jià)鍵的形式結(jié)合形成一個(gè)閉合的圓環(huán),使其具有相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[6]。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA在多種腫瘤中異常表達(dá),包括乳腺癌[7]、肺癌[8]、肝癌[9]、結(jié)直腸癌[10]及胰腺癌[11]等。最新研究顯示環(huán)狀RNA富含miRNA結(jié)合位點(diǎn),起到miRNA海綿的作用,從而在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)[12-17],如circRNA_001569過表達(dá)通過調(diào)控miR-145/NR4A2軸增強(qiáng)胃癌細(xì)胞活力,減少胃癌細(xì)胞凋亡[18];circRNA_100269通過靶向結(jié)合miR-630抑制胃癌細(xì)胞的增殖[19]。因此從環(huán)狀RNA角度進(jìn)一步篩選胃癌相關(guān)的新型靶點(diǎn),并深入探討其可能的分子機(jī)制,可能為胃癌的臨床診療提供新的治療方案。本研究通過從GEO數(shù)據(jù)庫中下載微陣列數(shù)據(jù),探索環(huán)狀RNA在胃癌中的作用,以期為胃癌的生物學(xué)研究提供新的標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 微陣列數(shù)據(jù) 從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載原始基因表達(dá)譜GSE78092(海南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)、GSE89143(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)和GSE83521(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院)。從上述3個(gè)數(shù)據(jù)庫中共獲得了12對(duì)胃癌組織和12對(duì)癌旁組織,通過GEO2R在線分析工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,并利用維恩圖在線工具(bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)鑒定數(shù)據(jù)的一致性。將調(diào)整后P<0.05和差異倍數(shù)(Fold change,FC)≥2作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異篩選,再次利用維恩圖在線工具篩選交集部分。

1.2 環(huán)狀RNA/miRNAs的相互作用 利用miRanda軟件和RNAhybrid軟件預(yù)測(cè)環(huán)狀RNA可能結(jié)合的miRNAs。采用Cytoscape軟件構(gòu)建環(huán)狀RNA/miRNAs相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 親本基因在胃癌中的表達(dá) 采用UALCAN在線軟件(源于TCGA數(shù)據(jù)庫)分析環(huán)狀RNA的親本基因在胃癌組織中的表達(dá),預(yù)測(cè)該環(huán)狀RNA與親本基因的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達(dá)的共同環(huán)狀RNA 通過對(duì)數(shù)據(jù)庫GSE78092、GSE89143和GSE83521進(jìn)行合并分析,發(fā)現(xiàn)共有1 708個(gè)環(huán)狀RNA,至少2個(gè)數(shù)據(jù)庫都存在的環(huán)狀RNA有343個(gè),其中15個(gè)環(huán)狀RNA為3個(gè)數(shù)據(jù)庫共同包含(圖1A)。進(jìn)行差異篩選后,發(fā)現(xiàn)共有508個(gè)差異表達(dá)的環(huán)狀RNA,至少2個(gè)數(shù)據(jù)庫都存在的環(huán)狀RNA有31個(gè),其中2個(gè)環(huán)狀RNA為3個(gè)數(shù)據(jù)庫共同包含(圖1B)。但在差異表達(dá)的環(huán)狀RNA中,有10個(gè)環(huán)狀RNA在上述數(shù)據(jù)庫中表達(dá)不一致,分別為hsa_circ_0092360、hsa_circ_0059369、hsa_circ_0032683、hsa_circ_0009594、hsa_circ_0007518、hsa_circ_0005927、hsa_circ_0005051、hsa_circ_0001789、hsa_circ_0000554和hsa_circ_0000519(圖1C)。將上述10個(gè)環(huán)狀RNA去除后再次分析,發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中上調(diào)的環(huán)狀RNA有125個(gè),下調(diào)的373個(gè),其中至少2個(gè)數(shù)據(jù)庫都存在的環(huán)狀RNA有21個(gè),且只有hsa_circ_0050102表達(dá)上調(diào),另外hsa_circ_0067934和hsa_circ_0013048是3個(gè)數(shù)據(jù)庫中均包含的,且在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)(圖1D,表1)。

1A:對(duì)3個(gè)GEO數(shù)據(jù)中所有環(huán)狀RNA進(jìn)行整合分析;1B:所有差異表達(dá)的環(huán)狀RNA在3個(gè)GEO數(shù)據(jù)中的分布;1C:10個(gè)環(huán)狀RNA在上述數(shù)據(jù)庫中表達(dá)不一致(藍(lán)色橢圓形代表在GSE78092中上調(diào);藍(lán)色六邊形代表在GSE89143中上調(diào);黃綠色矩形代表在GSE83521中上調(diào));1D:至少兩個(gè)數(shù)據(jù)庫都包含的在胃癌中差異表達(dá)的環(huán)狀RNA(紅色代表上調(diào),藍(lán)色代表下調(diào))

表1 在胃癌組織中差異表達(dá)的環(huán)狀RNA

2.2 預(yù)測(cè)差異表達(dá)的環(huán)狀RNA與miRNA的相互作用 通過上述篩選得出hsa_circ_0013048和hsa_circ_0067934為3個(gè)數(shù)據(jù)庫共同包含的環(huán)狀RNA,因此特異性相對(duì)較高。在其他下調(diào)的環(huán)狀RNA中,以差異倍數(shù)<0.4、長(zhǎng)度小于500 bp作為篩選條件,再次選擇hsa_circ_0000981、hsa_circ_0005273、hsa_circ_0018004和hsa_circ_0092337進(jìn)行后續(xù)探究。根據(jù)種子區(qū)堿基互補(bǔ)配對(duì),本研究預(yù)測(cè)環(huán)狀RNA可能結(jié)合的miRNAs,并構(gòu)建環(huán)狀RNA/miRNAs之間的網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。結(jié)果顯示hsa_circ_0092337預(yù)測(cè)的miRNAs最多,達(dá)55個(gè),且與hsa_circ_0018004有兩個(gè)共同的miRNAs,分別是miR-6775-5p和miR-5090。其次是hsa_circ_0005273,可與46個(gè)miRNAs結(jié)合,其中與hsa_circ_0013048有一個(gè)共同的miRNA:miR-3187-5p。而共同上調(diào)的環(huán)狀RNA為hsa_circ_0050102,其長(zhǎng)度為7 604 bp,序列太長(zhǎng)可能導(dǎo)致其功能單一性較差,因此本研究未預(yù)測(cè)其可能結(jié)合的miRNAs。

圖2 預(yù)測(cè)胃癌組織中部分下調(diào)的環(huán)狀RNA與miRNAs的相互作用

2.3 環(huán)狀RNA與其親本基因的關(guān)系 通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),胃腺癌組織與其癌旁組織的RPL13、LPHN2和PGPEP1表達(dá)無明顯差異(圖3A);而PRKCI、LAPTM4A、PTK2和PDSS1在胃腺癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織(圖3B)。

3A:hsa_circ_0092337、hsa_circ_0013048和hsa_circ_0050102的親本基因在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá);3B:hsa_circ_0067934、hsa_circ_0000981、hsa_circ_0005273和hsa_circ_0018004的親本基因在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

3 討論

環(huán)狀RNA在各種生物體內(nèi)廣泛存在,且在腫瘤組織中特異表達(dá),因此其可能成為潛在的生物學(xué)標(biāo)志[19]。環(huán)狀RNA在腫瘤中廣泛參與細(xì)胞的生物學(xué)功能,包括細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡[20],如hsa_circ_0072309通過海綿miR-492抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[21];circRNA_100290通過競(jìng)爭(zhēng)性海綿miR-516b上調(diào)了FZD4的表達(dá),從而激活Wnt/β-catenin通路,進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲,抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡[22]。然而環(huán)狀RNA在胃癌中的潛在作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究主要分析GEO數(shù)據(jù)庫中環(huán)狀RNA在胃癌組織中的表達(dá)情況,并篩選出共同差異表達(dá)的環(huán)狀RNA,通過對(duì)3個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行合并分析,發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中共有1 708個(gè)環(huán)狀RNA,其中至少兩個(gè)數(shù)據(jù)庫都存在的環(huán)狀RNA有343個(gè),但只有15個(gè)環(huán)狀RNA為3個(gè)數(shù)據(jù)庫共同包含,說明環(huán)狀RNA在不同的胃癌組織中分布差異較大,具有較高的人群差異性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在胃癌組織中,差異表達(dá)的環(huán)狀RNA共有508個(gè),其中至少兩個(gè)數(shù)據(jù)庫都存在的環(huán)狀RNA有31個(gè),其中2個(gè)環(huán)狀RNA為3個(gè)數(shù)據(jù)庫共同包含。但本研究發(fā)現(xiàn)同一環(huán)狀RNA在不同胃癌組織中表達(dá)趨勢(shì)相反,因此尚需在更多的胃癌組織中以及在相應(yīng)的細(xì)胞層面上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。將上述可疑表達(dá)的環(huán)狀RNA剔除后,共有498個(gè)差異表達(dá)的環(huán)狀RNA,其中上調(diào)的有125個(gè),下調(diào)的373個(gè)。其中hsa_circ_0067934和hsa_circ_0013048是三個(gè)數(shù)據(jù)庫中均包含的,暗示其在胃癌組織中表達(dá)特異性相對(duì)較高。有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA主要通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA影響下游靶基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的功能[8,12]。因此本研究進(jìn)一步對(duì)環(huán)狀RNA可能結(jié)合的miRNAs進(jìn)行了預(yù)測(cè),并構(gòu)建環(huán)狀RNA/miRNAs網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)果提示hsa_circ_0092337和hsa_circ_0005273預(yù)測(cè)的miRNAs最多,且與其他環(huán)狀RNA存在共同聯(lián)系的miRNAs,但其與miRNAs之間的聯(lián)系以及與環(huán)狀RNA的協(xié)同作用仍需通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

此外,還有研究發(fā)現(xiàn)外顯子-內(nèi)含子circRNAs(EIciRNAs)如circEIF3J和circPAIP2可以通過與U1 snRNP結(jié)合形成復(fù)合物,進(jìn)而促進(jìn)其親本基因的表達(dá)[23]。然而本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),RPL13、LPHN2和PGPEP1在胃腺癌組織中的表達(dá)與癌旁組織無明顯差異;而PRKCI、LAPTM4A、PTK2和PDSS1在胃腺癌組織中的表達(dá)卻高于癌旁組織,暗示這些環(huán)狀RNA可能與其親本基因無明顯關(guān)系,但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)鑒定他們之間的關(guān)系。