趙 鑫，常 穎，劉玉俠，趙 暉，盧衛(wèi)平，于 鴻，王 斌*

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長春130012)

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*通訊作者

不同效靶比CIK對(duì)小細(xì)胞肺癌殺傷效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

趙 鑫1，常 穎1，劉玉俠2，趙 暉1，盧衛(wèi)平1，于 鴻2，王 斌1*

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長春130012)

目的 探討細(xì)胞因子殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cells，CIK)與小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCIH-446在不同效靶比的情況下對(duì)NCIH-446的殺傷效果，為臨床合理應(yīng)用CIK治療腫瘤提供科學(xué)的數(shù)據(jù)。方法 體外培養(yǎng)CIK細(xì)胞并鑒定，與NCIH-446細(xì)胞在50∶1,25∶1,12.5∶1的比例下進(jìn)行共同培養(yǎng)，用xCELLigence RTCA S16實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀對(duì)兩者的作用進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，共監(jiān)測48 h。結(jié)果 CIK與NCIH-446在50∶1,25∶1,12.5∶1時(shí)，隨著時(shí)間的延長，CIK對(duì)NCI446的殺傷作用也逐漸提高，從2 h的74.18%，67.98%，46.76%到48 h的95.00%，96.95%，93.82%。但在同一時(shí)間段3種不同比例的殺傷活性，2 h和6 h有差異(P<0.01)，13 h后同時(shí)間段的殺傷活性沒有明顯差異，但殺傷效果均明顯提高。結(jié)論 CIK與NCIH-446在效靶比為50∶1、25∶1、12.5∶1時(shí)細(xì)胞的殺傷性在2 h，6 h時(shí)存在數(shù)量依賴關(guān)系，細(xì)胞數(shù)越高，殺傷活性越強(qiáng)。但隨著時(shí)間的延長，這種依賴關(guān)系不明顯，各種比例的細(xì)胞殺傷作用均不斷增強(qiáng)。

CIK細(xì)胞；小細(xì)胞肺癌細(xì)胞；殺傷活性

(ChinJLabDiagn,2016,20:1808)

生物治療在惡性腫瘤的治療中日益受到重視，被譽(yù)為腫瘤治療的第四大療法。由于它具有明確的殺傷腫瘤及提高免疫力的效果，并且沒有明顯的副作用，對(duì)于不能手術(shù)及放化療以及手術(shù)及放化療后的患者是很好的治療選擇。生物治療的細(xì)胞腫瘤很多，本實(shí)驗(yàn)選擇CIK進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，監(jiān)測其對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCIH-446的殺傷作用，為CIK用于小細(xì)胞肺癌的治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 IMDM培養(yǎng)基 購于GIBCO公司；IL-1α購于Peprotech公司;胎牛血清：購于天津康源公司；淋巴細(xì)胞分離液：購于天津?yàn)笊镏破房萍钾?zé)任有限公司；IL-2：購于北京四環(huán)生物制藥有限公司；anti-CD3Ab:Biolegend公司。anti-hunman CD3-FITC,anti-hunman CD16、CD56-PE,購自 BD公司；IFN-γ：購于天津?yàn)笊镏破房萍钾?zé)任有限公司；CD3+、CD4+、NK 、NKT 、CD3+HLA-DR+ 、CD8+CD28+熒光標(biāo)記單克隆抗體：購自美國BECKMAN COULTER公司。小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCIH-446：吉林省腫瘤防治研究所保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀XCELLigence RTCA S16，E-Plate16細(xì)胞檢測板:北京昊諾斯科技有限公司提供；低溫高速離心機(jī)，SORVALL公司；HERA CEEL 240iCO2培養(yǎng)箱，Thermo Scientific公司；流式細(xì)胞儀，BD公司。

1.2 方法

培養(yǎng)NCIH-446細(xì)胞：將凍存的NCI446細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，用0.25%胰酶進(jìn)行消化后，計(jì)數(shù)為6×104/ml,待用。首先向E-Plate16細(xì)胞檢測板中每孔加入50 μl含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液在370C，5%CO2培養(yǎng)箱測量基線，然后取出E-Plate16板，在超凈工作臺(tái)內(nèi)接種100 μl/孔已調(diào)好細(xì)胞數(shù)的NCIH-446。放入xCELLigence RTCA S16實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀中，再放回到37℃，5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后加入不同濃度的效應(yīng)細(xì)胞(CIK)，開始進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測CIK細(xì)胞對(duì)NCIH-446的殺傷效應(yīng)。設(shè)定指標(biāo)48 h，15 min測定1次。 效應(yīng)細(xì)胞CIK的制備及鑒定，見參考文獻(xiàn)[1]。將培養(yǎng)10天的CIK調(diào)細(xì)胞數(shù)為3×106/ml,按以下設(shè)計(jì)加到已接種靶細(xì)胞NCIH-446的E-Plate16細(xì)胞檢測板中，每孔100 μl，放入37℃。5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分4組，第1組:NCIH-446；第2組:CIK1+NCIH-446(50∶1)；第3組;CIK2+NCIH-446(25∶1)；第4組：CIK3+NCIH-446(12.5∶1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值成對(duì)二樣本進(jìn)行T檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

xCELLigence RTCA S16實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀監(jiān)測的CIK在不同時(shí)間，不同比例對(duì)NCIH-446的殺傷效果。圖中紅線為NCIH-446，粉線為CIK+NCIH-446(50∶1)，藍(lán)線為CIK+NCIH-446(25∶1)，綠線為CIK+NCIH-446(12.5∶1)。 見圖1，圖2。圖1顯示CIK對(duì)NCIH-446的殺傷作用在共同培養(yǎng)2個(gè) h左右就顯現(xiàn)出來，而且隨著時(shí)間的推移，殺傷效果不斷增強(qiáng)。圖2為CIK與NCIH-446在不同比例，不同時(shí)間殺傷效果圖。其中在2 h和6 h時(shí)12.5∶1的殺傷效果要低于50∶1和25∶1，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(P<0.01)，而13 h以后，各比例的殺傷效果在同一時(shí)間點(diǎn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有明顯差異(P>0.05)，但總體殺傷效果是隨著時(shí)間的推移逐漸提高，在48 h均達(dá)到了90%以上。

3 討論

小細(xì)胞肺癌的治療根據(jù)發(fā)病時(shí)間及確診時(shí)的病情發(fā)展情況等，可以選擇手術(shù)、化療、放療等治療方法，但由于其惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，細(xì)胞倍增時(shí)間短[2]，對(duì)于常規(guī)方法治療后的病人，容易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[3]。生物治療是目前腫瘤治療的一種新的手段，它可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，激活免疫系統(tǒng)，提高免疫力，因此，對(duì)手術(shù)、化療、放療后免疫功能的恢復(fù)，對(duì)微小轉(zhuǎn)移病灶的清除都將發(fā)揮一定作用[4]。

生物治療細(xì)胞的種類很多，包括樹突狀細(xì)胞(DC)、細(xì)胞因子活化的殺傷細(xì)胞(CIK)、自然殺傷細(xì)胞(NK)、T細(xì)胞，γδT細(xì)胞等。本實(shí)驗(yàn)選取了其中的CIK(cytokine-induced killer)細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，探討其對(duì)小細(xì)胞肺癌的體外殺傷作用，為其臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)。

圖1 CIK對(duì)NCIH-446的殺傷作用

圖2 CIK與NCIH-446在不同比例，不同時(shí)間殺傷效果(與12.5∶1相比，*P<0.01)

體外培養(yǎng)的CIK細(xì)胞可以表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子，所以又被稱為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，因此具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的殺傷活性和NK細(xì)胞無MHC限制性的優(yōu)點(diǎn)，使其應(yīng)用更加廣泛[5]。本實(shí)驗(yàn)通過不同細(xì)胞數(shù)量的CIK與小細(xì)胞肺癌NCIH-446共同培養(yǎng)，檢測不同效靶比以及培養(yǎng)不同時(shí)間的CIK對(duì)NCIH-446的殺傷作用，為臨床合理應(yīng)用CIK細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)用xCELLigence RTCA S16實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀監(jiān)測CIK與NCIH-446在50∶1,25∶1,12.5∶1的不同比例下對(duì)NCIH-446的殺傷作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)殺傷作用共進(jìn)行了48 h的實(shí)時(shí)監(jiān)測，從監(jiān)測結(jié)果可以看出，3種效靶比的CIK細(xì)胞在互相作用的2個(gè) h開始就起作用，而且隨著時(shí)間的延長，殺傷作用不斷增強(qiáng)，從2 h的74.18%，67.98,46.76到48 h分別達(dá)到95%，96.95%，93.82%，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，CIK細(xì)胞對(duì)NCIH-446有較強(qiáng)的殺傷作用，而且這種作用會(huì)隨著時(shí)間的推移不斷增強(qiáng)，這也提示如果給病人應(yīng)用CIK細(xì)胞進(jìn)行治療，由于體內(nèi)的環(huán)境要好于體外環(huán)境，CIK細(xì)胞會(huì)不斷增殖，殺傷效果及持續(xù)時(shí)間可能會(huì)更好。由于本實(shí)驗(yàn)只做了48 h的監(jiān)測，只能證明在48 h內(nèi)的殺傷作用是隨著時(shí)間的延長，殺傷效果越好。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為小細(xì)胞肺癌的臨床治療時(shí)細(xì)胞數(shù)量的選擇提供了數(shù)據(jù)，為小細(xì)胞肺癌的治療提供了除了手術(shù)、化療、放療外的一種新方法。

[1]趙 鑫，常 穎，劉玉俠，等.培養(yǎng)不同時(shí)間CIK細(xì)胞免疫表型變化與其抗腫瘤活性關(guān)系的研究[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2015,19(9)：1455.

[2]廖美琳，王慧敏.小細(xì)胞肺癌的治療進(jìn)展[J].腫瘤，2001,21(6)：399.

[3]劉 迪，樊 旼.小細(xì)胞肺癌分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J].中國癌癥雜志，2014,24(8)：630．

[4]劉清池，張慧敏，張玉娜，等.DC-CIK細(xì)胞清除微小殘留白血病的臨床研究[J].中國腫瘤生物治療雜志，2013,20(4)：398.

[5]Hontscha,Borck Y,Zhou H,et al.Clinical trials on CIK cells:First report of the international registry on CIK cells(IRCC)[J].J cancer Res Clin Oncol,2011,137(2):305.

The experimental study of CIK killing effect on small cell lung cancer in different effector target ratio

ZHAOXin,CHANGYing,LIUYu-xia,etal.

(JilinProvinceTumorHospital,Changchun130012,China)

Objective Investigate the killing effect which Cytokines killer cells(cytokine induced killer cells,CIK)have on small cell lung cancer cell NCIH-446 in different effector target ratio and provide scientific data for reasonable clinical application of CIK in cancer treatment.Methods Culture CIK cells in vitro and make the identifition,then co-culture CIK cells with NCIH-446 cells in 50∶1,25∶1,12.5∶1 proporation,monitor their effect with xCELLigence RTCA S16 unmarked cell function analyzer in real-time for 48 hours.Results When CIK and NCIH-446 are in 50∶1,25∶1,12.5∶1 proporation,the killing effect CIK has on NCI446 improves from 74.18%,67.98%,46.76% in the 2 hour to 95.00%,96.95%,93.82%in the 48 hour with the extension of time.at the same time,the killing activity in 3 different proporations differs between the 2 hour and the 6 hour(P<0.01),13 hours later,the killing activity has no significant differences but the killing effect improves obviously.95.00%,96.95%,93.82%in the 48 hour with the extension of time.at the same time,the killing activity in 3 different proporations differs between the 2 hour and the 6 hour(P<0.01),13 hours later,the killing activity has no significant differences but the killing effect improves obviously.Conclusion When CIK and NCIH-446 are in 50∶1,25∶1,12.5∶1 effector target ratio,the killing effect of cells has the number of dependencies in the 2nd and 6th hour,the higher cell number,the higher killing activity but with the extension of time,the dependency is not obvious and the killing effect of cells in different proporation is increasing.

CIK cells;small cell lung cancer cell;killing activity

1007-4287(2016)11-1808-03

R734.2

A

2016-04-14)