姚歡歡，陳思思，邵錦暉，陳 吉

(1湖州市第三人民醫(yī)院·浙江 湖州 313002； 2杭州市富陽區(qū)中醫(yī)院·浙江 杭州 311400)

乳腺癌已成為當(dāng)今世界危害女性身心健康最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率高居女性惡性腫瘤的首位[1]，根據(jù)美國國家腫瘤研究所預(yù)測，每個女性在其一生中有13.2%的概率患乳腺癌[2-3]。乳腺癌的發(fā)病率增長速度很快，采取早期診斷、早期治療手段能夠明顯提高乳腺癌的治療效果，然而，乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是乳腺癌的主要死因，因此尋求有效的抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的藥物已成為當(dāng)下的研究熱點[4]。蜘蛛香，又被稱為馬蹄香、老虎七、土細(xì)辛等，系敗醬科纈草屬植物蜘蛛香(ValerianaJatamansiJones)的干燥根莖和根。近年來，關(guān)于蜘蛛香提取物在抗焦慮以及抗氧化等方面的作用都有報道[5-6]，然而，目前對蜘蛛香抗腫瘤作用的研究主要集中在蜘蛛香中的環(huán)烯醚萜化合物[7-8]。蜘蛛香總黃酮(total flavonoids fromValerianaJatamansiJones，TFV)是蜘蛛香中的主要活性成分之一，具有抗炎、抑菌、抗腫瘤等作用[9]，然而其在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移當(dāng)中的作用及機(jī)制少有報道。因此，本文擬以具有強(qiáng)侵襲性的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231為研究對象，研究TFV對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響并進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞 乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購買于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 實驗藥物 蜘蛛香購于貴州遵義市藥材市場；根據(jù)文獻(xiàn)提供方法[10]，采用超生提取法，從干燥粉末中提取TFV，用大孔樹脂進(jìn)行純化后，經(jīng)紫外分光光度法測得總黃酮含量為44.38%，將藥物至于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清：美國Hyclone公司，批號：SH30021.01、SH30084.03；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒：上海碧云天公司，批號：P0013K、P0012；四甲基亞唑藍(lán)(MTT)、DMSO：美國Sigma公司，批號：M2128、D2650；Matrigel膠：北京索萊寶科技有限公司，批號：356234；熒光定量PCR試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix：日本Takara公司，批號：RR036Q；一抗(MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH)：美國CST公司，批號：40994、13667、3194、13116、5741、5174；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗、ECL顯影液：美國BIO-RAD公司，批號：350003248、102030719。

1.4 儀器 SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；3111型二氧化碳培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；ECLIPSE Ti型熒光倒置顯微鏡：日本Nikon公司；MDF-U3386S 型超低溫冰箱：日本Sanyo公司；X715 XK-8型轉(zhuǎn)移脫色搖床：江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；PowerPac Basic電泳儀：美國BIO-RAD公司；3300 Mini化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：中國CLinX公司；CFX-Connect型熒光定量PCR儀：美國Bio-Rad公司；移液槍(多規(guī)格)：德國Eppendorf公司。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、青霉素200 U/mL、鏈霉素200 U/mL的完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d換液1 次，待細(xì)胞密度至80%～90%，以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，取對數(shù)期細(xì)胞用于實驗。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞相對存活率 收集對數(shù)期MDA-MB-231細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3 000個/孔，每孔100 μL加入到96孔板，置37 ℃含有5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后加入TFV，其藥液終濃度分別為0、10、20、30、40、50、60 mg/L，用藥組和對照組均設(shè)4個復(fù)孔繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL濃度為5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后每孔加入200 μL三聯(lián)液，將96孔板放到外用37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用18 h，在570 nm條件下測定吸光度OD值。

2.3 細(xì)胞劃痕實驗檢測MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力 取對數(shù)期細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min。棄去上清，加入適量完全培養(yǎng)基懸浮沉淀，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度。以 6×105個/孔的細(xì)胞密度接種于6 孔板中培養(yǎng)。待細(xì)胞長成單層即棄去培養(yǎng)液，用200 μL的槍頭在24孔板每孔中央劃出一道劃痕，洗去死細(xì)胞后顯微鏡下拍照。按實驗設(shè)計分空白對照組、20 mg/L組、40 mg/L組，處理24、48 h 后，在同一觀察點處顯微鏡拍照記錄細(xì)胞生長情況，實驗重復(fù)3次。利用Image J軟件測量每孔多個點劃痕間距，取均值，并用處理前的距離減去處理后的距離即為24 h和48 h細(xì)胞遷移距離。

2.4 Transwell實驗檢測MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力 將無血清培養(yǎng)基500 μL，水化基底膜10 min，上室加入200 μL濃度為2×104個/mL的細(xì)胞懸液，下室分別加入500 μL 含TFV質(zhì)量濃度為0、20、40 mg/L的無血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。從培養(yǎng)箱中取出小室，棄去上室液體，用甲醇固定5 min，PBS洗3次，用蘇木素和尹紅各染5 min，自來水沖洗，沖去殘余的染料。用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，Transwell小室反過來底朝上在正置顯微鏡下觀察，拍照，計數(shù)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，即細(xì)胞從小室上室穿越Matrigel膠和聚碳酯膜的細(xì)胞侵襲數(shù)。

2.5 熒光定量PCR法檢測MDA-MB-231細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)水平 將0、20、40 mg/L的TFV處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，采用熒光定量PCR試劑盒檢測MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參。

MMP-2上游引物：5’-AATGCCATCCCTGATAACCT-3’,下游引物：5’-GCTTCCAAACTTCACGCTCT-3’。MMP-9上游引物：5’-TCCCTGGAGACCTGAGAACC-3’，下游引物：5’-GCCACCCGAGTGTAACCAT-3’。GAPDH上游引物：5’-ACTTTGGTATCGTGGAAGGACTCAT-3’，下游引物5’-GTTTTTCTAGACGGCAGGTCAGG-3’。

2.6 Western blot檢測MDA-MB-231細(xì)胞MMP-2、MMP-9以及EMT相關(guān)蛋白表達(dá) 將狀態(tài)良好的MDA-MB-231細(xì)胞以8×105/孔傳代于6 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁之后，按照分組的情況加入含有不同濃度TFV的完全培養(yǎng)基，作用24 h后加入裂解液，冰上裂解30 min后離心(12 000 r/min)取上清，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，處理蛋白隨后上樣。用SDS-PAGE分離總蛋白，隨后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育2 h后顯影。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 每組實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，采用兩獨立樣本t檢驗統(tǒng)計學(xué)方法，當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TFV對MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性的影響 見圖1。隨著TFV濃度逐漸升高，其對MDA-MB-231細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到50 mg/L時出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。表明TFV能夠在一定程度上抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，呈現(xiàn)劑量依賴性。選擇低于50 mg/L的TFV濃度作為后續(xù)侵襲轉(zhuǎn)移實驗的藥物濃度，以排除其抗增殖能力對實驗結(jié)果的影響。

與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 TFV對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用

3.2 TFV對MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響 見圖2，質(zhì)量濃度為20、40 mg/L的TFV作用于MDA-MB-231細(xì)胞12 h和24 h后，劃痕的愈合能力顯著低于空白對照組(P<0.05)，并呈劑量依賴性。此結(jié)果表明，TFV有抑制乳腺癌細(xì)胞遷移的能力。

注：與空白對照組比較, *P<0.05圖2 細(xì)胞劃痕實驗檢測TFV對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231遷移能力的影響

3.3 TFV對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響 見圖3。TFV加藥組單個視野下侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯小于空白對照組(P<0.01)。表明TFV可抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的侵襲能力。

注：與空白對照組比較,*P<0.05, **P<0.01圖3 Transwell侵襲實驗檢測TFV對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231侵襲能力的影響

3.4 TFV對MMP-2和MMP-9轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平的影響 見圖4～圖5。加藥組MMP-2、MMP-9 mRNA蛋白表達(dá)量較空白對照組顯著降低(P<0.01)，表明TFV能夠在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)。

注：與空白對照組比較,*P<0.05, **P<0.01圖4 qRT-PCR法檢測TFV對MMP-2和MMP-9轉(zhuǎn)錄水平的影響

3.5 TFV對MDA-MB-231細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 見圖6。相對于空白對照組，加藥組中E-cadherin含量顯著上升，而N-cadherin和Vimentin含量顯著下降(P<0.01)，并且均呈現(xiàn)劑量依賴性。表明TFV能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生EMT。

4 討論

中藥蜘蛛香，主要化學(xué)成分有揮發(fā)油，環(huán)烯醚萜類和黃酮類等[11]，其中黃酮類化合物抗腫瘤的作用研究已有諸多報道[12]。目前已有報道稱，蜘蛛香中總黃酮對肝癌和結(jié)腸癌的增殖都具有一定的抑制作用[13-14]，而其在抗乳腺癌轉(zhuǎn)移方面的作用及機(jī)制尚未闡明。本研究首先通過MTT實驗證明了高濃度的TFV對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長有抑制作用，因此本實驗選擇無顯著細(xì)胞毒性的藥物濃度對TFV的抗乳腺癌轉(zhuǎn)移作用進(jìn)行研究。通過細(xì)胞劃痕實驗、Transwell小室實驗證實TFV可以明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并呈劑量依賴性。

注：與空白對照組比較,*P<0.05, **P<0.01圖5 Western blot實驗檢測TFV對MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的影響

注：與空白對照組比較,*P<0.05, **P<0.01圖6 Western blot實驗檢測TFV對EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N- cadherin以及Vimentin表達(dá)水平的影響

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族是一類結(jié)構(gòu)中含鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶，其與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在MMPs家族中，MMP-2和MMP-9可以通過分解基膜Ⅵ膠原和層黏連蛋白促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。目前已有數(shù)據(jù)證實，乳腺癌腫瘤中MMP-2和MMP-9表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，表明MMP-2和MMP-9的高表達(dá)與乳腺癌的轉(zhuǎn)移具有密切的關(guān)系[16]。因此，通過檢測MMP-2和MMP-9表達(dá)水平可以判斷乳腺癌患者病情和預(yù)后情況。本研究通過qRT-PCR和Western blot實驗證實了TFV能夠顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步從分子和蛋白層面說明TFV能夠在體外抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是乳腺癌細(xì)胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力的主要途徑，與惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)[15]，其主要特征為上皮細(xì)胞的極性喪失，導(dǎo)致細(xì)胞間的粘附能力減弱，從而演變成間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和特征，具備了游走的能力[17]。EMT發(fā)生的主要標(biāo)志主要包括上皮性鈣粘附蛋白E-cadherin表達(dá)下調(diào)或消失，以及神經(jīng)性鈣粘附蛋白N-cadherin和波形蛋白Vimentin表達(dá)上調(diào)[18]。本研究中Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，TFV加藥組中E-cadherin蛋白表達(dá)顯著增加，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)顯著降低，并呈現(xiàn)劑量依賴性。此結(jié)果表明TFV能夠誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)的增加，從而有效抑制間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制MDA-MB-231細(xì)胞間極性的喪失，阻止MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)展，即阻止MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生EMT。

綜上所述，蜘蛛香總黃酮具有明確的抗乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用，其機(jī)制可能是通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)，本研究為臨床使用蜘蛛香總黃酮治療乳腺癌提供了實驗依據(jù)。