楊 馨,劉 娜,張佩青,王海艷,陳 明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036)

水蛭是有破血、逐瘀、消癥功效的一味蟲類藥，其主要成分為蛋白質(zhì)及多肽分子，按藥理分為直接作用于凝血系統(tǒng)的活性成分、其他蛋白酶抑制劑組分，以及一些小分子化合物和微量元素[1]。水蛭制劑在腎臟疾病的治療中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[2]，在前期的實(shí)驗(yàn)研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)水蛭能夠保護(hù)FSGS大鼠腎臟，減輕腎臟病理形態(tài)學(xué)改變，減少細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的重要組成部分Ⅳ型膠原蛋白和纖維粘連蛋白的表達(dá)，使局灶節(jié)段性腎小球硬化的進(jìn)程得到延緩[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶類是調(diào)控ECM降解的重要酶類，參與ECM的重塑并穩(wěn)定組織的發(fā)育和內(nèi)環(huán)境，其中MMP-9主要降解Ⅳ型膠原蛋白，TIMP-1是MMP-9的特異性抑制因子，MMP-9與TIMP-1的動(dòng)態(tài)平衡在ECM的生理平衡中起關(guān)鍵作用[4-5]。本實(shí)驗(yàn)觀察水蛭對(duì)FSGS大鼠腎臟MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其延緩局灶節(jié)段性腎小球硬化進(jìn)程的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SPF級(jí)Wistar大鼠52只，180～220 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-(吉)2011-0003；由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.2 主要藥品與試劑 水蛭江陰顆粒(0.5 g/袋：相當(dāng)于飲片3 g)：江陰天江藥業(yè)有限公司。阿霉素：輝瑞制藥(無錫)有限公司；兔抗大鼠MMP-9多克隆抗體、兔抗大鼠TIMP-1多克隆抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；PV-6001兔抗鼠二抗：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 2135型切片機(jī)：德國萊卡；CK-2型光學(xué)顯微鏡：CH型攝影顯微鏡：日本OLYMPUS；美國moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)。

1.4 模型制備、分組 實(shí)驗(yàn)大鼠購入后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組12只，假手術(shù)組12只，造模組28只。造模組行左腎切除術(shù)，術(shù)后大鼠無死亡，術(shù)后第7天經(jīng)尾靜脈注射阿霉素4 mg/kg，7 d后再將造模組大鼠隨機(jī)平均分為模型組(14只)與水蛭組(14只)。模型組與水蛭組于術(shù)后第35天經(jīng)尾靜脈再次注射阿霉素3 mg/kg。假手術(shù)組僅剝離腎臟脂肪包膜，并予等量的生理鹽水于相同時(shí)間點(diǎn)尾靜脈注射。正常組不作處理。

1.5 給藥 術(shù)后第14天，水蛭組采用水蛭0.9 g/(kg·d)灌胃；假手術(shù)組、模型組予等體積容量蒸餾水灌胃。共治療8周。

1.6 腎組織MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化PV6001二步法。分別于給藥后第4周末，第8周末測(cè)定腎組織MMP-9、TIMP-1蛋白的表達(dá)。于400倍下以moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)攝片，以積分光密度(IOD)代表蛋白相對(duì)表達(dá)量，采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽性表達(dá)進(jìn)行定量分析，IOD=陽性面積×平均光密度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織MMP-9 表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果 第4、8周正常組與假手術(shù)組MMP-9在腎小球臟層上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞有少量表達(dá)，與正常組、假手術(shù)組比較，模型組和水蛭組MMP-9表達(dá)增多(P<0.01)。第4、8周水蛭組與模型組比較，MMP-9表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)。見圖1，表1。

圖1 各組大鼠4、8 周腎組織MMP-9免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×400)

表1 各組大鼠4、8 周腎組織MMP-9表達(dá)光密度的比較

2.2 各組大鼠腎組織TIMP-1表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果 第4、8周正常組與假手術(shù)組TIMP-1在腎小球上皮、內(nèi)皮、系膜、腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)有表達(dá)，與正常組、假手術(shù)組比較，模型組和水蛭組TIMP-1表達(dá)增多(P<0.01，P<0.05)。第4、8周水蛭組與模型組比較，TIMP-1表達(dá)減少(P<0.01)。見圖2，表2。

圖2 各組大鼠4、8 周腎組織TIMP-1免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×400)

表2 各組大鼠4、8周腎組織TIMP-1表達(dá)光密度的比較

3 討論

FSGS是原發(fā)腎病綜合征的一種病理類型，在我國發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，有調(diào)查顯示2005至2009年東北地區(qū)FSGS占原發(fā)性腎小球疾病的比例為4%[6]，華中地區(qū)FSGS所占成人原發(fā)腎病綜合征比例由從2009至2010年的5.8%增加到2011至2012年的14.7%[7]。治療上以激素和免疫抑制劑為主，但這些藥物的毒副作用不可忽視，中醫(yī)藥在減少蛋白尿及延緩腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化方面，以及減少激素、免疫抑制劑副作用方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。目前研究認(rèn)為，腎小球ECM的過度積聚是 FSGS 的重要病理改變[8]，ECM產(chǎn)生的主要來源是腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞，當(dāng)腎小球受到創(chuàng)傷時(shí)，其內(nèi)存在的使ECM降解的酶類則合成增加來促進(jìn)ECM降解[9-10]。阿霉素致局灶節(jié)段性腎小球硬化模型可以較好的模擬FSGS的病變過程[11]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者認(rèn)為造模后隨著病變的逐漸進(jìn)展，ECM合成增多，MMP-9為降解ECM，其表達(dá)開始逐漸增強(qiáng)，同時(shí)誘導(dǎo)TIMP-1表達(dá)相應(yīng)也增強(qiáng)，隨著時(shí)間延長，給藥8周末各造模組MMP-9表達(dá)有所減弱、但TIMP-1表達(dá)仍呈逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，說明MMP-9出現(xiàn)表達(dá)減弱，可能是由于TIMP-1表達(dá)持續(xù)增多，MMP-9被逐漸消耗所致，其對(duì)ECM的降解作用減弱，故ECM增多，導(dǎo)致FSGS的發(fā)生。水蛭可以通過上調(diào)MMP-9、降低TIMP-1蛋白的表達(dá)，從而加強(qiáng)對(duì)ECM的降解，減輕ECM積聚；提示水蛭對(duì)ECM的主要降解酶系之一的基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)具有調(diào)控作用，可能是其干預(yù)FSGS進(jìn)展的作用機(jī)制之一。