胡 爽，辛傳偉，余霞麗，夏仲尼，羊 波，呂立嵩

(浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江省立同德醫(yī)院 ·浙江 杭州 310012)

糖尿病腎病 (diabetic kidney disease, DKD)為糖尿病多發(fā)并且嚴(yán)重的并發(fā)癥，嚴(yán)重危害人類健康，目前已逐漸成為誘發(fā)終末期腎病 (end-stage renal disease, ESRD)的最主要原因，其發(fā)病機制和防治策略是目前臨床的研究熱點[1]。核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)為一多效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，研究表明，其與炎癥因子的產(chǎn)生、免疫反應(yīng)、細胞外基質(zhì)積聚、細胞增殖凋亡等密切相關(guān)[2-3]，在 DKD發(fā)病機制中起重要作用。消渴平合劑是浙江省中醫(yī)藥研究院醫(yī)院制劑，課題組前期動物實驗證實該制劑可減少尿蛋白排泄、抑制TGF-β1的表達[4-5]，但其對NF-κB、IL-6因子表達的影響尚不清楚。因此，本實驗擬通過觀察消渴平合劑對DKD db/db小鼠NF-κB 和IL-6因子的影響，深入探索其治療DKD的機理，為臨床尋找防治DKD的作用靶點及藥物信號通路提供有益的線索。

1 實驗材料

1.1 藥品 消渴平合劑：由浙江省中醫(yī)藥研究院制劑室生產(chǎn)，由黃芪、生地黃、丹參、山藥等組方而成，批準(zhǔn)文號：浙藥制字Z20100002。厄貝沙坦片：杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司。

1.2 實驗動物 挑選11周齡SPF級肥胖型雄性db/db小鼠24只用于實驗，體質(zhì)量(40.74±0.92)g。另選8只db/m小鼠作為空白對照組，體質(zhì)量(23.35±0.74)g。實驗期間觀察組及空白對照組小鼠自由飲水、進食。所有實驗小鼠購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物許可證號：SCXK(滬)2017-0015。

1.3 實驗試劑和儀器 兔多克隆抗體NF-κB p65：沈陽萬類生物科技有限公司；IL-6抗體：美國Abcam公司；Trizol Reagent：生工生物工程(上海)股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。Tanon5200全自動化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司；全自動生化分析儀：日本HITACHI。

2 實驗方法

2.1 實驗分組與給藥 24只實驗用db/db小鼠采取隨機數(shù)字表法分為3組：模型對照組(MC組，8只)給予生理鹽水20 mL/(kg·d)灌胃；厄貝沙坦組(IB組，8 只)予厄貝沙坦17.5 mg/(kg·d)灌胃給藥；消渴平組(XKP組，8 只)予消渴平8 g/(kg·d)灌胃給藥；空白對照組db/m小鼠(NC組，8 只)，給予生理鹽水20 mL/(kg·d)灌胃，以上所有實驗用小鼠均連續(xù)給藥觀察8周。

2.2 觀察指標(biāo)及測定

2.2.1 血糖、血脂相關(guān)指標(biāo)檢測 所有實驗組小鼠在第8周給藥后禁食不禁水12 h,采取眼眶靜脈取血，分離動物血清，利用全自動生化分析儀檢測糖化血清蛋白(Glycosylated serum protein，GSP)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白變化(HDL-C)水平。

2.2.2 腎組織NF-κB p65 mRNA、IL-6 mRNA及蛋白表達檢測 實驗第8周給藥后禁食不禁水12 h處死實驗用小鼠，留取左腎，分離皮、髓質(zhì)，置于-80 ℃冰箱中備用。NF-κB p65 mRNA和IL-6mRNA的表達利用熒光定量PCR的方法檢測，總RNA提取采用Trizol 法，行逆轉(zhuǎn)錄合成，內(nèi)參基因為β-actin，PCR實驗引物設(shè)計如表1所示，每個樣品做3個復(fù)孔，實驗數(shù)據(jù)采用 2-△△CT法進行匯總分析。腎臟NF-κB p65蛋白、IL-6蛋白的表達采用Western blot 法檢測，稱取左腎組織50 mg，嚴(yán)格按試劑盒說明書進行操作，收集蛋白，進行電泳，然后行轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗、二抗孵育，利用Image Lab軟件對各實驗檢測條帶進行比較分析。

表1 熒光定量PCR實驗引物設(shè)計表

3 結(jié)果

3.1 消渴平對db/db小鼠糖化血清蛋白GSP水平的影響 見表2。

表2 各組小鼠GSP水平比較

3.2 消渴平對db/db小鼠血脂水平的影響 見表3。

表3 各組小鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平的比較

3.3 消渴平對db/db小鼠腎組織NF-κB p65 mRNA、IL-6 mRNA表達的影響 見表4。

表4 各組小鼠腎組織NF-κB p65 mRNA、IL-6 mRNA表達的比較

3.4 消渴平對db/db小鼠腎組織NF-κB p65、IL-6蛋白表達的影響 見表5，圖1。

表5 各組小鼠腎組織NF-κB p65、IL-6蛋白表達的比較

圖1 各組小鼠腎組織NF-κB p65、IL-6蛋白表達的Western blot電泳圖

4 討論

糖尿病腎病(DKD)的具體發(fā)病機理非常復(fù)雜，目前還不十分明確。有研究發(fā)現(xiàn)，在DKD患者中，其外周血NF-κB表達水平與尚未發(fā)生并發(fā)癥的糖尿病患者及健康人群相比有顯著差異[6]；提示核因子NF-κB在DKD的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，抑制NF-κB相關(guān)信號通路的表達是DKD重要的治療方向。NF-κB是進化高度保守的 Rel家族蛋白，調(diào)控參與多種炎癥、免疫反應(yīng)、細胞凋亡及癌癥基因表達[7]。NF-κB的序列機構(gòu)特點決定了其各個亞型必須形成二聚體才可發(fā)揮生物學(xué)作用，NF-κB p65是最常見的二聚體之一。

白介素6(IL-6)是一種炎性反應(yīng)的啟動因子，其同時具有抗炎和促炎的作用[8]。在 NF-κB信號通路中包含TNF-α、IL-6及IL-8等相關(guān)的細胞因子，NF-κB的活化可增強IL-6的基因轉(zhuǎn)錄，使IL-6產(chǎn)生和釋放增多，誘導(dǎo)炎癥信號放大；因此， IL-6基因的變化可反映NF-κB信號通路的激活[9]。

本實驗通過研究發(fā)現(xiàn)，相比db/m小鼠，模型組db/db小鼠的腎組織NF-κB p65蛋白、IL-6蛋白以及NF-κB p65 mRNA、IL-6 mRNA的表達均明顯升高，說明隨著DKD病程進展，NF-κB相關(guān)信號通路被激活，相關(guān)細胞因子水平有逐步升高的趨勢，而經(jīng)過相關(guān)藥物進行治療8周后，無論是消渴平組還是厄貝沙坦組均可顯著降低NF-κB p65蛋白、IL-6蛋白、NF-κBp65 mRNA、IL-6 mRNA的表達(P<0.05)。

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為，DKD屬消渴病，其病理基礎(chǔ)和主要病機是瘀血阻絡(luò)[10]，因此，在臨床中醫(yī)治療 DKD，活血化瘀通絡(luò)中藥已成為復(fù)方的重要組成部分。本實驗采用的消渴平合劑為醫(yī)院制劑，是省級名中醫(yī)史奎均遵循祖國中醫(yī)“消渴”的基礎(chǔ)病機，根據(jù)多年臨床行醫(yī)經(jīng)驗研發(fā)，由于目前針對活血化瘀通絡(luò)類中藥深入的基礎(chǔ)研究尚不多見，因此本課題組開展了消渴平合劑干預(yù)DKD 的系列基礎(chǔ)研究，前期動物實驗發(fā)現(xiàn)該藥可明顯降低空腹血糖，增強胰島素敏感性[4]，本實驗通過8周的觀察發(fā)現(xiàn)，與db/m組小鼠相比，模型組小鼠GSP水平顯著升高(P<0.01)，TG、TC、LDL-C水平顯著升高(P<0.01)，HDL-C水平顯著降低(P<0.01)；說明模型組小鼠出現(xiàn)典型的糖毒性、血脂紊亂。而藥物干預(yù)8周后，消渴平治療組小鼠GSP水平顯著降低(P<0.05)，TG、TC、LDL-C水平明顯降低(P<0.05)，HDL-C水平明顯升高(P<0.05)；說明消渴平治療組小鼠糖毒性以及血脂紊亂得到了明顯改善。

總之，本次實驗通過觀察消渴平對db/db小鼠GSP以及血脂水平的影響，發(fā)現(xiàn)消渴平可明顯降低db/db小鼠糖化血清蛋白水平，可調(diào)節(jié)血脂，其具體作用機制可能與降低腎臟NF-κB p65、IL-6基因和蛋白的表達有關(guān)，但具體的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機制，尚有待進一步研究。