葛杰，徐志遠(yuǎn),李鑫，劉健，楊德全，鞠厚斌，葛菲菲*

(1. 上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103；2. 揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)H9亞型在全球野生鳥類中傳播，并且在亞洲、中東和非洲國家的許多家禽中呈地方流行[1-2]。盡管它們是低致病性禽流感病毒(LPAIV)，受感染的雞會有輕微的呼吸道疾病，死亡率一般低于20%[3-4]，但仍然令農(nóng)業(yè)和衛(wèi)生部門擔(dān)憂。H9亞型流感會影響肉雞體重、蛋雞的產(chǎn)蛋量和育種雞的質(zhì)量[5-6]。另外，受感染的家禽更容易繼發(fā)感染[7]，群體死亡率最高能達(dá)到65%[8]。

家禽中的H9禽流感病毒會對人類構(gòu)成人畜共患病風(fēng)險(xiǎn)。自從1998年第1次正式報(bào)告人感染H9N2，孟加拉國、中國、埃及、巴基斯坦和阿曼共有59例人的病例[9]。人感染一般無癥狀或表現(xiàn)為輕度呼吸道疾病，只有1例相關(guān)死亡報(bào)告，可能是由于共感染導(dǎo)致[10]。在人群中檢測到的所有H9N2病毒與同期的家禽病毒基因上是相似的[9]。H9禽流感病毒通常通過重組，將內(nèi)部基因組片段供應(yīng)給非H9病毒，產(chǎn)生可能對畜牧業(yè)和人類健康構(gòu)成威脅的禽流感基因型[11]。2013年以來在中國發(fā)現(xiàn)的最普遍的AIV是H9基因型[1,11]。本研究對上海市某活禽市場2019年11月分離到的4株H9N2亞型AIV進(jìn)行全基因進(jìn)化分析，以期為了解上海地區(qū)H9N2 AIV 流行情況及其防控和疫苗選擇提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 病毒株

4株H9N2亞型AIV毒株由本實(shí)驗(yàn)室參照文獻(xiàn)[12]分離保存，其詳細(xì)背景見表1。

表1 4株H9N2禽流感病毒毒株的信息

1.2 SPF雞胚及主要試劑

SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。H9熒光RT-PCR試劑盒由深圳匹基提供。新城疫陽性血清、禽流感血凝素分型血清(H5、H9)由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。AMV反轉(zhuǎn)錄酶等試劑均購自寶生物(大連)工程公司；特異引物由寶生物(大連)工程公司合成。

1.3 8個(gè)基因的擴(kuò)增及序列分析

按照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行病毒RNA的提取和8個(gè)基因的全長擴(kuò)增，測序由上海桑尼生物科技有限公司完成。參照GenBank中相關(guān)參考毒株， 用 MEGA3.1構(gòu)建鄰近樹，自展值設(shè)為1 000次，自展值≥60%顯示在主要的節(jié)點(diǎn)上，本研究中的4株病毒用實(shí)心三角標(biāo)記。

1.4 序列分析比較

采用DNAStar軟件包(Madison, WI, USA)的EditSeq和MegAlign，對增加病毒適應(yīng)性的分子特征進(jìn)行分析以及抗原位點(diǎn)相關(guān)的氨基酸變化進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 全基因組同源性分析

4株病毒全基因節(jié)段的NCBI登錄號為MN918119～918150。分離株HA基因ORF全長為1 683 bp，編碼560個(gè)氨基酸，核苷酸同源性為91.8%～99.9%，氨基酸序列同源性為93.6%～99.8%。分離株的HA基因與A/Duck/Y280/1997的HA基因核苷酸同源性為88.5%～89.0%，氨基酸同源性為89.3%～92.0%。分離株NA基因ORF全長為1 401 bp，編碼466個(gè)氨基酸，核苷酸同源性為97.4%～98.9%，氨基酸序列同源性為97.2%～98.9%。4株病毒內(nèi)部基因M、NP、NS、PA、PB1和PB2核苷酸同源性分別為98.7%～99.5%， 93.1%～94.1%， 98.8%～99.8%，95.7%～96.2%，97.8%～98.4%和96.7%～96.8%。

2.2 8個(gè)基因遺傳演化分析

利用Mega3.1軟件對分離毒株和參考毒株8個(gè)基因的遺傳演化關(guān)系進(jìn)行分析，繪制遺傳演化樹(圖1至圖8)。結(jié)果顯示，所有分離株均為Y280系。根據(jù)繪制的8個(gè)基因節(jié)段的遺傳演化樹進(jìn)行分析，4株分離株重組模式完全相同，均為四重重組體，由Y280亞系、Unknown、G1以及F98重組而成，根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)[14]，這4株病毒均屬于G57基因型。

圖1 4株H9N2亞型禽流感病毒HA基因節(jié)段的基因進(jìn)化樹

圖2 4株H9N2亞型禽流感病毒NA基因節(jié)段的基因進(jìn)化樹

圖3 4株H9N2亞型禽流感病毒NP基因節(jié)段的基因進(jìn)化樹

圖4 4株H9N2亞型禽流感病毒PA基因節(jié)段的基因進(jìn)化樹

圖5 4株H9N2亞型禽流感病毒M基因節(jié)段的基因進(jìn)化樹

圖6 4株H9N2亞型禽流感病毒NS基因節(jié)段的基因進(jìn)化樹

圖7 4株H9N2亞型禽流感病毒PB1基因節(jié)段的基因進(jìn)化樹

圖8 4株H9N2亞型禽流感病毒PB2基因節(jié)段的基因進(jìn)化樹

2.3 4株H9N2禽流感病毒適應(yīng)性增強(qiáng)的分子特征分析

表2顯示了已知的影響禽流感病毒致病性的氨基酸突變，這4個(gè)毒株的HA裂解位點(diǎn)均為PSRSSR/GLF。這4株HA基因含有3個(gè)共同的氨基酸突變和1個(gè)只有A/Chicken/ Shanghai/1103/2019發(fā)生的突變，3個(gè)共同的突變分別為：155位為T，248位為D以及226位為L，A/Chicken/ Shanghai/1103/2019毒株在158位突變?yōu)镹；這4株病毒分別為 PB2基因上588位為V，在PB1-F2縮短為90 aa以及622位突變?yōu)镚；PA基因的63位和356位突變?yōu)镮和R，均為全長PA-X；NP基因上105位氨基酸突變?yōu)閂；M1基因上43位氨基酸突變?yōu)镸；M2的31位突變?yōu)镹；在NS1的42位突變?yōu)镾，在NS1的149位突變?yōu)锳。

表2 4株H9N2流感病毒基因上與增強(qiáng)病毒適應(yīng)性相關(guān)的氨基酸突變

2.4 H9N2流感病毒與目前使用的疫苗株同源性比較

根據(jù)已報(bào)道的33個(gè)抗原位點(diǎn)[15]，這4株病毒與2株疫苗株(A/Chicken/Shandong/6/96和A/Chicken/Shanghai/F/98)最多有18個(gè)抗原位點(diǎn)的差異(表3)。這4株病毒和目前國內(nèi)使用的疫苗A/chicken/Shandong/6/96 (6/96)和A/chicken/Shanghai/F/98 (F/98)核苷酸和氨基酸同源性分別為88.4%～89.1%和88.9%～92.0%。

表3 4株H9N2流感病毒與2株疫苗株HA上抗原位點(diǎn)比較

3 討論

近年來發(fā)現(xiàn)，H9N2亞型AIV是可以感染人的新型H7N9亞型AIV內(nèi)部基因的供體，這一發(fā)現(xiàn)使得H9N2亞型AIV 成為公共安全的潛在威脅。因此，探究病毒演化過程中基因的變化對掌握病毒流行規(guī)律具有重要意義。目前國內(nèi)流行的H9N2亞型AIV的HA、NA雖然以CK/Bei-like分支基因型為主，但其內(nèi)部基因經(jīng)常被其他分支的基因節(jié)段所取代，出現(xiàn)越來越多的重組基因型。Pu等[11]研究表明，G57在2007年出現(xiàn)，其流行率在2009年劇增，并自2010年后在中國占主導(dǎo)地位。本研究分離的4株H9N2亞型AIV均屬于G57。G57在雞群中適應(yīng)性增強(qiáng)部分是由于獲得了G1系的M和PB2基因，這些基因增加了禽流感病毒的聚合酶活性、復(fù)制能力以及毒力[15]。分子分析表明這4株病毒含有多個(gè)適應(yīng)哺乳動物的氨基酸位點(diǎn)，這4株病毒均含有Q226L的突變，從而明顯增加H9流感病毒與人Sia-α-2,6-唾液酸受體的結(jié)合，增強(qiáng)禽流感病毒在豚鼠間的傳播[15]。H9N2流感病毒的6個(gè)內(nèi)部基因也存在一些突變，導(dǎo)致在哺乳動物中復(fù)制能力和毒力增強(qiáng)，雖然PB2基因上并未發(fā)現(xiàn)流感病毒適應(yīng)哺乳動物的2個(gè)位點(diǎn)E627K和D701N，但是4個(gè)毒株均含有A588V，該位點(diǎn)能增強(qiáng)哺乳動物和禽細(xì)胞系上H7N9和H9N2聚合酶活性和復(fù)制能力，從而增強(qiáng)AIV在哺乳動物上的毒力。自從2013年以來，全球范圍內(nèi)攜有A588V的H9N2以及H7N9病毒已經(jīng)明顯增加[15]。禽群的免疫以及生物安全程序能有效減少AIV的傳播，從而減少了人群暴露感染的風(fēng)險(xiǎn)。目前我國使用的2種疫苗株A/chicken/Shandong/6/96(6/96)和A/chicken/Shanghai/F/98(F/98)均為90年代的毒株，由于抗原漂移，H9亞型禽流感疫苗的有效性持續(xù)降低。本試驗(yàn)中的4株病毒與上述2種疫苗株最多有18個(gè)抗原位點(diǎn)差異，這種變異與疫苗有效性的降低是否有關(guān)還需進(jìn)一步評估?？傊?，H9N2流感病毒在上海市活禽市場的持續(xù)流行提示，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)流感病毒的監(jiān)測和預(yù)警。