包成, 李鐵成

1丹東市第一醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地麻醉科(遼寧丹東 118000) ； 2 錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院麻醉科(遼寧錦州 121000)

心血管疾病是全球病死率最高的疾病，其中急性心肌梗死(acute myocardial Infarction, AMI)發(fā)病極為兇險,后果最為嚴重[1]?，F(xiàn)有的有效治療手段主要有溶栓術，經(jīng)皮冠脈介入治療等臨床方法，通過醫(yī)學手段實現(xiàn)血流再通[2]。但在實現(xiàn)心肌缺血再灌注的同時，部分患者心肌缺血癥狀反而加重，甚至出現(xiàn)了心肌細胞的大面積壞死的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury, I/R)，發(fā)病機制主要有氧自由基的增加，鈣超載，炎癥因子的作用及能量代謝障礙等[3-4]。減輕心肌缺血再灌注損傷是一個亟待解決的問題，藥物的預處理是近年來的醫(yī)學研究熱點。據(jù)研究表明芒柄花素對心血管有一定的保護作用，且有較強的抗炎作用，可以抑制各種炎性因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)的釋放和表達，可防治以炎癥為基礎的疾病演變[5]。但由于芒柄花素難溶解于水，而芒柄花素磺酸鈉(sodium formononetin-3′-sulfonate，Sul-F)是芒柄花素的磺化產(chǎn)物，在不影響藥理作用的前提下大幅度提高了水溶性[6]。因此，2019年6—9月，本研究通過構建心肌缺血再灌注SD大鼠模型，觀察芒柄花素磺酸鈉對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用，從而為心肌缺血的臨床治療提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 芒柄花素磺酸鈉(大連美侖生物技術有限公司，批號：N0922A)。

1.2 動物 SD健康雄性大鼠(錦州醫(yī)科大學動物實驗中心提供)。

1.3 試劑 髓過氧化酶(MPO)試劑盒(南京建成生物公司)，TNF-α試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，IL-1β試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，肌酸激酶(CK-MB)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.4 儀器 小動物呼吸機(成都泰盟軟件有限公司)，心電監(jiān)護儀(北京邁瑞醫(yī)療)，酶標儀(美國Molecular Devices 公司)。

1.5 實驗方法 選擇健康雄性SD大鼠32只，每只體重范圍240～300 g,隨機分成4組，每組8只，分別為假手術組、缺血再灌注模型組(模型組)、芒柄花素磺酸鈉高劑量組(高劑量組)、芒柄花素磺酸鈉低劑量組(低劑量組)。大鼠稱重分組后，術前12 h禁食，可正常飲水。前5 d給予不同劑量芒柄花素磺酸鈉的預處理，低劑量組20 mg/kg，高劑量組40 mg/kg。假手術組和模型組給予等量生理鹽水安慰劑。其中假手術組，冠狀動脈左前降支下穿線，不結扎，其余3組均給予結扎30 min，再灌注120 min。

1.5.1 造模方法 將大鼠用20%的烏拉坦溶液腹腔注射麻醉后，固定于實驗操作臺，氣管插管后固定行機械通氣。吸氣與呼氣的比約為1∶2，潮氣量30 mL/kg。提起表皮于四肢皮下輕刺入針形電極，監(jiān)測并記錄大鼠Ⅱ導聯(lián)心電圖。選取胸骨左緣3～4肋間處作一切口，開胸并暴露心臟，用無創(chuàng)縫合線穿過左冠狀動脈前降支的下方約2 mm處，位于左心耳與肺圓錐動脈之間，再將縫線穿過自制的套管，系緊縫線阻斷血流30 min左右，再剪短繩結給予再灌注120 min。以監(jiān)測系統(tǒng)心電圖的ST段抬高幅度≥0.15～0.2為結扎成功標準，而再灌注后ST段回落幅度超過50%為再灌注成功標志[7]。

1.5.2 指標檢測方法 以上各組于再灌注末期取血，滴入離心管，將離心管放置于離心機中，設置轉速3 000 r/min，離心10 min，取血清。用比色法測定MPO的活性,用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測定CK-MB、TNF-α和IL-1β的活性,以上各項操作嚴格按照試劑盒說明書來執(zhí)行。剪掉心臟，將心尖放置于甲醛溶液中冷藏保存，心肌組織放置于-80℃的深凍冰箱中保存。組織切片做HE染色，于光學顯微鏡下觀察心肌組織的病理變化。

2 結果

2.1 各組心律失常的發(fā)生率 與假手術組比較，各組均有心律失常的發(fā)生，而高劑量組、低劑量組的室性心律失常的發(fā)生率遠小于模型組，高劑量組的作用強于低劑量組。見表1。

表1 各組大鼠心律失常的發(fā)生率

2.2 芒柄花素磺酸鈉對I/R大鼠心肌損傷程度的影響 在HE染色后，可以明顯見到假手術組細胞形態(tài)結構無異常，而模型組大量細胞核溶解，固縮，部分細胞核碎裂，肌纖維紊亂，且伴有大量炎性細胞浸潤。高劑量組、低劑量組處理后的心肌損傷有明顯改善，細胞損傷較輕，少量炎性細胞浸潤。見圖1。

2.3 芒柄花素磺酸鈉對I/R大鼠血清中CK-MB、MPO、TNF-α及IL-1β活性的影響 (1)TNF-α的含量，模型組遠高于假手術組(P<0.001)、低劑量組(P<0.001)和高劑量組(P<0.001)，且高劑量組優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。(2)IL-1β的含量,低劑量組與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但假手術組<高劑量組<低劑量組<模型組，高劑量組與低劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(3)大鼠心肌損傷后MPO的含量大幅度增加，經(jīng)過芒柄花素磺酸鈉20、40 mg/kg處理后，各組MPO含量有所減少，呈劑量-效應關系。(4)與模型組相比，給藥后的各組CK-MB的釋放明顯減少(P<0.01)。見表2。

注：A:假手術組；B:模型組;C:低劑量組;D:高劑量組；于400倍視野下觀察，給藥組大鼠心肌損傷程度明顯減輕，高劑量組優(yōu)于低劑量組

表2 芒柄花素磺酸鈉對心肌缺血再灌注大鼠血清中各項生化指標的影響

3 討論

藥物的干預是近年來心肌缺血再灌注損傷的一個研究熱點，而炎癥因子在心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機制中占有重要地位。MPO代表著中性粒細胞的活化程度，通過調節(jié)細胞信號通路誘導炎癥相關基因的表達，因此MPO可以預測心肌損傷的嚴重程度[8-9]。Calmarza等[10]研究顯示 MPO水平的變化與急性冠脈綜合征明顯正相關(P<0.001)，MPO于再灌注早期就有所表達，表達程度可能與心肌梗死面積相關，主要功能是形成具有氧化作用的自由基，造成心肌損傷。同樣當心肌損傷時，大量的心肌酶如CK-MB會釋放入血，血液中的酶含量急劇升高，心肌損傷則進一步加重。本實驗中模型組大鼠血清中MPO、CK-MB的含量遠高于其他三組，說明了芒柄花素磺酸鈉對心肌有一定的保護作用。

TNF-α和IL-1β于再灌注早期發(fā)揮了重要作用[11]。在炎癥反應的過程中由于中性粒細胞的大量聚集導致血管堵塞再灌注效果不理想，同時會釋放出大量的TNF-α和IL-1β[12-13]。TNF-α可以誘導細胞凋亡，并且與內皮細胞結合產(chǎn)生的過氧化物陰離子通過刺激髓過氧化物酶產(chǎn)生更多的炎性因子，從而加重炎癥反應。IL-1β由單核巨噬細胞分泌，持續(xù)升高會加重心肌損傷，且IL-1β與TNF-α有協(xié)同作用[13]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)芒柄花素磺酸鈉可以抑制TNF-α和IL-1β的過度表達，可見芒柄花素磺酸鈉對心肌缺血再灌注時損傷的保護作用可能與抑制炎癥反應有關，其具體機制有待進一步探討。