王萬(wàn)民, 田濤

三門(mén)峽市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科(河南三門(mén)峽 472000)

甲狀腺功能亢進(jìn)癥(甲亢)是一種常見(jiàn)疾病，由甲狀腺激素分泌過(guò)多引起，會(huì)引起高代謝、免疫炎癥反應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)興奮性增加，導(dǎo)致體重減輕、肝損傷、心血管疾病等并發(fā)癥[1-2]，甲亢性心臟病是其中常見(jiàn)并發(fā)癥，過(guò)多甲狀腺激素可引起心肌細(xì)胞代謝加速、交感-迷走神經(jīng)張力失衡、心肌炎性及氧化應(yīng)激等，最終導(dǎo)致心肌重構(gòu)、心肌纖維化及心功能不全等心臟病理改變[3-4]；另外炎癥因子會(huì)降低胰島素敏感性，引發(fā)甲亢性心臟病患者胰島素抵抗，且研究發(fā)現(xiàn)心肌胰島素抵抗引發(fā)心臟病理改變，促發(fā)心血管疾病，因此恢復(fù)心肌胰島素信號(hào)正常激活具有重要心血管保護(hù)作用[5-6]。PI3K/Akt通路可調(diào)控心肌炎癥反應(yīng)，鹽酸右美托咪定通過(guò)激活該通路可降低炎癥因子合成，抑制炎癥反應(yīng)，減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷[7]，另外PI3K/Akt通路還介導(dǎo)胰島素抵抗過(guò)程，脫氧野百合素可通過(guò)激活糖尿病小鼠骨骼肌PI3K/Akt通路顯著提高其胰島素敏感性[8]，因而推測(cè)PI3K/Akt通路可能通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)調(diào)控胰島素抵抗，進(jìn)而影響甲亢大鼠心肌損傷過(guò)程。2017年9月至2019年3月本研究通過(guò)建立甲亢大鼠模型，對(duì)其心肌細(xì)胞PI3K/Akt通路與胰島素抵抗的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體重(180±20)g，購(gòu)自維通利華動(dòng)物試驗(yàn)中心提供，合格證編號(hào)：SCXK2017-0003，飼養(yǎng)在本院動(dòng)物房，維持溫度18～25℃，相對(duì)濕度50%～70%，12/12 h交替光照，自由攝食、飲水。

1.1.2 主要試劑與儀器 左旋甲狀腺素鈉(日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社)，批號(hào)：XIBRG-OD；LY294002(美國(guó)MCE公司)，貨號(hào)：HY-10108 ；740Y-P(美國(guó)Selleck生物科技有限公司)，貨號(hào)：S7865；游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3)、游離甲狀腺素(free thyroxine，F(xiàn)T4)及促甲狀腺素(thyroid stimulating hormone，TSH)ELISA測(cè)定試劑盒(北京北方生物技術(shù)有限公司)，批號(hào)均為：201611001；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、大鼠白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)ELISA試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司)，批號(hào)分別為：201702、201702；兔源GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT一抗、羊抗兔二抗(美國(guó)Abcam公司)，貨號(hào)分別為：ab181602、ab151549、ab138364、ab179463、ab38449、ab150077；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、BCA試劑盒(上海碧云天公司)，貨號(hào)分別為：C1088、P0013K、P0011等。CKX41-F32F顯微鏡(日本 Olympus 公司)；血糖測(cè)試儀(強(qiáng)生上海醫(yī)療器械有限公司)；Cobas E602全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀(Roche公司)；Elx800酶標(biāo)儀、1659001蛋白電泳儀、Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀、Chemi-Doc XRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；Centrifuge 5424R低溫高速離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf 股份公司)等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及分組給藥 參照文獻(xiàn)[9]，SD大鼠每天以280 μg/kg劑量皮下注射左旋甲狀腺素鈉，持續(xù)7 d，禁食12 h，行尾靜脈取血，檢測(cè)血清中FT3、FT4、TSH含量，F(xiàn)T3、FT4水平顯著升高，TSH顯著水平降低，表示模型制備成功。共制備模型40只，成功36只，隨機(jī)分為模型組、LY294002組、740Y-P組，每組12只；另取12只大鼠等劑量皮下注射生理鹽水，設(shè)為對(duì)照組。

參照文獻(xiàn)，以生理鹽水分別溶解LY294002、740Y-P配制為溶液，LY294002組大鼠0.3 mg/kg[10]劑量尾靜脈注射，740Y-P組大鼠以3.5 mg/kg[11]劑量腹腔注射。對(duì)照組大鼠與模型組大鼠，以與LY294002組同劑量生理鹽水尾靜脈注射，與740Y-P組等劑量的生理鹽水腹腔注射，持續(xù)7 d。

1.2.2 標(biāo)本收集及大鼠甲狀腺功能指標(biāo)檢測(cè) 用藥結(jié)束后，大鼠禁食12 h，麻醉后處死，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血5 mL，分出2 mL離心取血清，以ELISA測(cè)定試劑盒分別檢測(cè)其中FT3、FT4及TSH含量，具體操作參照說(shuō)明書(shū)。解剖分離心肌組織，剪取約0.5 g儲(chǔ)存在-80℃冰箱備用，剩余組織以生理鹽水漂洗干凈，4%多聚甲醛固定、梯度酒精(從低到高)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，采用切片機(jī)做病理切片備用。

1.2.3 大鼠空腹血糖水平(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index，IRI)測(cè)定 采用血糖測(cè)試儀檢測(cè)1.2.2中腹主動(dòng)脈血(2 mL)中FBG水平，并以全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)其中胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平，然后計(jì)算IRI，公式為：IRI=FBG×FINS/22.5。

1.2.4 大鼠心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 1.2.2中切片經(jīng)脫蠟、高濃度到低濃度酒精漂洗后，以3%H2O2溶液室溫孵育15 min，然后以TUNEL試劑盒進(jìn)行染色，具體操作參照說(shuō)明書(shū)，再次以低濃度到高濃度酒精脫水、二甲苯透明，最后封片，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，任意選取5視野拍照，計(jì)算凋亡細(xì)胞率=凋亡細(xì)胞/(凋亡細(xì)胞+正常細(xì)胞)×100%。

1.2.5 大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6水平測(cè)定 1.2.2中的腹主動(dòng)脈血1 mL離心取血清，以ELISA試劑盒檢測(cè)其中TNF-α、IL-6水平，具體操作參照說(shuō)明書(shū)。

1.2.6 蛋白印跡法檢測(cè)PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)檢測(cè) 1.2.2中心肌組織剪碎后，加入蛋白裂解液制備為勻漿液后離心取上清液，參照說(shuō)明書(shū)步驟以BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，煮沸變性后取等量蛋白樣品上樣，進(jìn)行電泳分離蛋白，然后將其濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，根據(jù)目的蛋白分子量大小截取蛋白條帶置于孵育盒中，分別加入兔源GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT一抗，4℃孵育，置于搖床上過(guò)夜，TBST洗膜3次，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗中孵育2 h，再次洗膜后，以ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像，以Gel-ProAnalyzer 4軟件分析各條帶灰度值，得出各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠甲狀腺功能情況 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清FT3、FT4顯著升高，TSH顯著降低；與模型組比較，LY294002組大鼠血清FT3、FT4升高，TSH降低；740Y-P組大鼠血清FT3、FT4降低，TSH升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠甲狀腺功能比較(n=12)

2.2 各組大鼠FBG水平與IRI值 與對(duì)照組比較，模型組大鼠FBG水平、IRI值顯著升高；與模型組比較，LY294002組大鼠FBG水平、IRI值升高；740Y-P組大鼠FBG水平、IRI值降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況 與對(duì)照組比較，模型組大鼠凋亡心肌細(xì)胞比例顯著升高；與模型組比較，LY294002組大鼠凋亡心肌細(xì)胞比例升高；740Y-P組大鼠凋亡心肌細(xì)胞比例降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表3。

表2 各組大鼠FBG、IRI水平比較(n=12)

注：A：對(duì)照組；B：模型組；C：LY294002組；D：740Y-P組。正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈棕黃色

表3 各組大鼠凋亡心肌細(xì)胞比例比較(n=12)

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著升高；與模型組比較，LY294002組大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高；740Y-P組大鼠血清TNF-α、IL-6水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較(n=12)

2.5 各組大鼠心肌組織PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt顯著降低；與模型組比較，LY294002組大鼠血清心肌組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt降低；740Y-P組大鼠血清p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表5。

表5 各組大鼠心肌組織PI3K/Akt通路蛋白相對(duì)表達(dá)比較(n=12)

3 討論

甲亢病因主要由甲狀腺功能本身的增加而分泌更多甲狀腺激素，中國(guó)發(fā)病率約為1.2%[12]，甲亢性心臟病是其嚴(yán)重并發(fā)癥之一，心臟在高水平甲狀腺素長(zhǎng)期作用下，會(huì)產(chǎn)生心肌肥厚、心肌重構(gòu)及心肌纖維化等嚴(yán)重病理?yè)p傷，導(dǎo)致心力衰竭、心肌梗死或心律失常等心血管疾病，嚴(yán)重影響甲亢患者預(yù)后[13]。甲亢患者普遍存在胰島素抵抗，原因與患者機(jī)體炎癥反應(yīng)及胰島素受體數(shù)量下降密切相關(guān)[14-15]，而胰島素抵抗作為機(jī)體異常病理狀態(tài)，在動(dòng)脈粥樣硬化性、心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起顯著作用[16]，因此關(guān)于胰島素抵抗的研究對(duì)甲亢性心臟病的臨床治療具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T3、FT4、TSH作為甲狀腺功能指標(biāo)，在甲亢患者中FT3、FT4明顯升高，TSH明顯下降，使得患者機(jī)體處于高代謝狀態(tài)，對(duì)葡萄糖的吸收增強(qiáng)，血糖升高，造成糖代謝功能紊亂[17]；炎性因子IL-6、TNF-α，可促進(jìn)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等心肌損傷，在甲亢性心臟病病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13-14,18]。本研究以皮下注射左旋甲狀腺素鈉方法建立甲亢模型大鼠，結(jié)果顯示持續(xù)注射7 d后，大鼠血清FT3、FT4、TNF-α及IL-6水平、心肌細(xì)胞凋亡比例、FBG、IRI顯著升高，TSH顯著降低，表明建模大鼠甲狀腺功能增強(qiáng)，血糖升高，出現(xiàn)甲亢癥狀及胰島素抵抗，發(fā)生炎癥反應(yīng)，造成心肌凋亡受損，提示造模成功。

PI3K/Akt通路在機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)及胰島素抵抗中起重要調(diào)控作用，黃芪多糖可通過(guò)激活該通路減輕缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[19]；且二甲雙胍可通過(guò)促使該通路磷酸化激活，降低2型糖尿病大鼠的肝胰島素抵抗[20]，因而推測(cè)心肌細(xì)胞PI3K/Akt通路可能通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)影響胰島素抵抗。本研究結(jié)果顯示，模型大鼠心肌組織p-PI3K/PI3K及p-Akt/Akt降低，經(jīng)PI3K/Akt通路抑制劑LY294002處理后，大鼠心肌組織p-PI3K/PI3K及p-Akt/Akt降低，血清FT3、FT4、TNF-α及IL-6水平、心肌細(xì)胞凋亡比例、FBG、IRI升高，TSH降低；經(jīng)PI3K/Akt通路激動(dòng)劑740Y-P處理后，大鼠心肌組織p-PI3K/PI3K及p-Akt/Akt升高，血清FT3、FT4、TNF-α及IL-6水平、心肌細(xì)胞凋亡比例、FBG、IRI降低，TSH升高，表明甲亢大鼠心肌細(xì)胞PI3K/Akt通路介導(dǎo)胰島素抵抗，該通路在甲亢大鼠中磷酸化水平相比正常大鼠明顯降低，處于抑制狀態(tài)，促使其磷酸化激活可使甲狀腺功能恢復(fù)正常，抑制炎癥反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞凋亡，改善胰島素抵抗。

綜上所述，甲亢大鼠心肌細(xì)胞PI3K/Akt通路與其胰島素抵抗密切相關(guān)，調(diào)控該通路可影響甲狀腺功能及胰島素抵抗，進(jìn)而調(diào)控炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)心肌凋亡過(guò)程。PI3K/Akt通路在甲亢大鼠中磷酸化水平明顯降低，上調(diào)其磷酸化水平，促使其激活可促進(jìn)甲狀腺正常功能的恢復(fù)，抑制炎癥發(fā)生，降低心肌細(xì)胞凋亡比例，改善胰島素抵抗，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的合成分泌影響炎癥反應(yīng)，進(jìn)而介導(dǎo)甲亢大鼠胰島素抵抗，但本研究未進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該過(guò)程，且細(xì)胞因子TNF-α、IL-6調(diào)節(jié)胰島素抵抗的具體分子機(jī)制也未進(jìn)行探討，存在不足，需要后續(xù)的深入研究。