趙紅梅,陳建平,張 屏,張 燁,李 冰,包保全

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué),內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

沙冬青,又名孟和哈日嘎訥,是中國重要的珍惜瀕危物鐘[1-2]。在寒冷的冬天,蒙古農(nóng)牧民的手腳就容易凍傷,把沙冬青的莖葉煮沸,用浸泡液浸泡傷處,有明顯療效。據(jù)目前的考證,該屬僅有2 種,分別為新疆沙冬青Ammopiptanthus nanus (M.Pop.) Chengf 和蒙古沙冬青Am-mopiptanthus mongolicus (Maxim.) Chengf.[3]。

沙冬青是唯一的荒地常綠灌木,是當(dāng)前荒地改造的優(yōu)良植物,也是一種有毒植物,可導(dǎo)致牲畜中毒和死亡,也可用作農(nóng)業(yè)殺蟲劑[4]。目前,對沙冬青的化學(xué)成分和生物活性篩選進(jìn)行的研究尚未見報(bào)道。為探索沙冬青中具有藥效活性的物質(zhì)基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行化學(xué)成分研究,并進(jìn)行細(xì)胞毒活性篩選測定[5],以期為合理開發(fā)利用這一植物資源提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 制備液相色譜儀(日本Shimadzu Corporation 公司)；分析液相色譜儀(美國Agilent 公司)；98-1-B 電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；DK-98-ⅡA 型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；KQ-500DE 超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Hei-VAP Precision 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；SHZ-D 循環(huán)水真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；艾科浦超純水機(jī)(重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)；GoodSee-Ⅱ薄層拍攝儀(上海科哲生化科技有限公司)。

1.2 試劑與藥物 蝦卵(美國Ruby Artemia 公司)；無碘海鹽(美國Sigma-aldrich 公司)。95% 乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、碘化鉍鉀、硅鎢酸、鎂粉、氯化鋁、氯化鐵、濃硫酸、濃鹽酸、乙酸酐(遼寧九熙商貿(mào)有限公司)。

1.3 樣品 蒙古沙冬青于2018 年9 月從內(nèi)蒙古阿拉善盟采集,由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)包保全教授鑒定為豆科沙冬青屬植物蒙古沙冬青 Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.)Chengf。將樣品儲存在實(shí)驗(yàn)室中,自然干燥并粉碎成粗粉,通過50 目篩后使用。

2 方法

2.1 提取與分離 取1 kg 干燥的蒙古沙冬青粗粉,95%乙醇回流萃取3 次,75%乙醇回流并萃取3 次,每次2 h[6],濾過,合并濾液,回收溶劑至浸膏238.8 g,溶于水,加熱,用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取,將其濃縮并干燥,分別得到相 應(yīng)部分17.1 g、13.3 g、8.28 g、60.4 g。余下水層經(jīng)C18中低壓液相,依次用95% 乙醇、50%乙醇、蒸餾水進(jìn)行洗脫,濃縮溶劑,得7 個部位的提取物,低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞毒活性測定 采用豐年蝦幼蟲作為實(shí)驗(yàn)對象[7]。稱取無碘海鹽2 g,加到1 000 mL 蒸餾水中,制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的人工海水(pH 8.0～8.5)。取2 g 豐年蝦的蝦卵放入人工海水中,并不間斷通氧,28 ℃避光孵化24 h,即得幼蟲,備用。

2.2.1 分組與給藥 將實(shí)驗(yàn)分成4 組,將7 個部位的提取物分別用人工海水制備成10、100、1 000 μg/mL 樣品溶液,將5 mL 溶液置于10 mL 試管中,并用人工海水作為陰性對照,每個樣品測3 次,用移液槍將幼蟲轉(zhuǎn)移到試管中,每管20 只,在28 ℃水浴下培養(yǎng)24 h。

2.2.2 測定與結(jié)果處理 將試管中的蝦倒入培養(yǎng)皿中,通過放大鏡計(jì)算出每個試管中死亡幼蟲的數(shù)量(無運(yùn)動),計(jì)算校正死亡率,公式為校正死亡率=[(T-C)/ (1-C) ]×100% (T 為樣品致死率,C 為陰性對照致死率)。采用SPSS 軟件的Prohibit 模型,計(jì)算半數(shù)致死濃度(LC50)[8]。

2.3 理化檢識

2.3.1 生物堿檢識 通過細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn),獲得活性部位是水層、乙酸乙酯層、正丁醇層,甲醇溶解,配制成溶液。碘化鉍鉀法為取1 mL 樣品,加入1～2 滴碘化鉍鉀,如果有紅棕色沉淀,則呈陽性。硅鎢酸法為取1 mL 樣品,加入1～2 滴硅鎢酸,如果有淡黃色或灰白色沉淀,則呈陽性。

2.3.2 黃酮檢識

2.3.2.1 鹽酸-鎂粉反應(yīng) 取樣品溶液,加入1 mL 甲醇,加入少量鎂粉,搖勻,加入幾滴濃鹽酸,1～2 min 內(nèi)即可顯色,若反應(yīng)顯紫紅色,則呈陽性。

2.3.2.2 三氯化鋁反應(yīng) 取樣品溶液,將樣品溶液滴在濾紙上分2 行,然后在下行滴加三氯化鋁,上行用作空白對照。置于紫外燈下,如果滴有三氯化鋁的一行顯淡黃色熒光,則呈陽性。

2.3.2.3 三氯化鐵反應(yīng) 取試管中的樣品溶液,加入氯化鐵的乙醇溶液,觀察現(xiàn)象,如果顯紫色,則呈陽性。

2.3.3 三萜皂苷檢識

2.3.3.1 Liebermann-Burchard 反應(yīng) 取粉末樣品,加入醋酸酐混合,加入幾滴濃硫酸-乙酸酐(1∶20),觀察。如果顏色變化從黃色變?yōu)榧t色、紫色、藍(lán)色、污綠色,則呈陽性。

2.3.3.2 Salkowski 反應(yīng) 取適量樣品粉末溶于三氯甲烷中,然后沿管壁慢慢加入濃硫酸,若上層出現(xiàn)紅色,下層出現(xiàn)綠色熒光,則呈陽性。

2.3.3.3 泡沫反應(yīng) 取適量樣品,加10 倍量水,煮沸10 min 后過濾,濾液置試管,若經(jīng)振搖后產(chǎn)生持久性泡沫,則呈陽性。

2.4 薄層層析

2.4.1 對照品溶液制備 稱取苦參堿、山柰酚、齊墩果酸、對照品各0.5 mg,用甲醇溶解定容至2 mL,制備成0.25 mg/mL 的溶液作為對照,放于4 ℃冰箱中備用。

2.4.2 供試品溶液制備 各稱取1 mg 乙酸乙酯層、正丁醇層、水層樣品,分別加入少許甲醇溶解定容至5 mL,即得0.2 mg/mL 供試品溶液,置于4 ℃冰箱中備用。

2.4.3 生物堿薄層層析 用毛細(xì)管分別吸取對照品、供試品溶液各1 μL,點(diǎn)于硅膠GF254板上,以氯仿-甲醇-氨水(8∶2∶0.4)[9]為展開劑,碘化鉍鉀為顯色劑。

2.4.4 黃酮薄層層析 用毛細(xì)管吸取對照品、供試品溶液各1 μL,點(diǎn)于G 板上,采用乙酸乙酯-甲醇-水(8∶1∶1)[10]為展開系統(tǒng),1%三氯化鋁溶液為顯色劑,365 nm 下觀察。

2.4.5 三萜皂苷薄層層析[11]用毛細(xì)管吸取對照品、供試品溶液各1 μL,點(diǎn)于GF254板上,采用石油醚-乙酸乙酯-乙醇(9∶7∶1) 為展開系統(tǒng),展距10 cm,吹干,噴以10%濃硫酸-乙醇溶液,置于105 ℃條件下顯色完全。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞毒活性 細(xì)胞毒活性與癌細(xì)胞抑制之間存在相關(guān)性[12],由海蝦的致死活性來測定。通過海蝦的致死法測定半數(shù)致死量,若粗提物的LC50＜1 000 μg/mL,單體的LC50＜100 μg/mL,則表明樣品具有明顯的活性[13]。圖1 表明,乙酸乙酯層、正丁醇層和水層均具有一定的細(xì)胞毒活性。其中,水層的活性最強(qiáng),對海蝦幼蟲致死的LC50值為70.02 μg/mL。三者的細(xì)胞毒活性存在顯著差異 (P ＜0.05)[14],有強(qiáng)到弱依次為水層、乙酸乙酯層、正丁醇層。

圖1 海蝦幼蟲致死生物活性測定結(jié)果

3.2 活性部位檢識 通過對蒙古沙冬青7 個提取部位細(xì)胞毒活性測定,顯示3 個部位有細(xì)胞活性,將這3 個有效部位的提取物進(jìn)行理化檢識,見表1。由此可知,水層物質(zhì)與生物堿檢識試劑呈陽性,與黃酮檢識試劑和三萜皂苷檢識試劑均呈陰性,表明水層中含有生物堿,不含有黃酮和三萜皂苷；乙酸乙酯層物質(zhì)與生物堿檢識試劑和三萜皂苷檢識試劑均呈陰性,與黃酮檢識試劑呈陽性,表明乙酸乙酯層含有黃酮而無三萜皂苷和生物堿；正丁醇層物質(zhì)與生物堿檢識試劑和黃酮檢識試劑呈陽性,與三萜皂苷檢識試劑呈陰性,表明正丁醇層含有生物堿和黃酮而無三帖皂苷。

表1 蒙古沙冬青不同有效部位理化檢識結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜對蒙古沙冬青3 個有效部位的提取物進(jìn)行分析,結(jié)果見圖2。圖2A 從左到右分別是正丁醇層、乙酸乙酯層、水層,苦參堿作為對照品,從圖中斑點(diǎn)的數(shù)量和顏色深淺分析,只有正丁醇層和水層顯示相同的斑點(diǎn),而乙酸乙酯層物質(zhì)沒有顯示斑點(diǎn),而且水層中的生物堿種類和含有量超出正丁醇層中的；圖2B 從左到右分別是正丁醇層、乙酸乙酯層、水層,山柰酚作為對照品,從圖中得知,只有正丁醇層物質(zhì)和乙酸乙酯物質(zhì)含有黃酮類,水層在365 nm 的紫外熒光下均未見相同熒光；圖2C 從左至右依次為正丁醇層、乙酸乙酯層、水層,齊墩果酸作為對照品,在對照品顯色的對應(yīng)位置上,正丁醇層、乙酸乙酯層、水層都不顯示斑點(diǎn)。

圖2 各樣品薄層色譜圖

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對蒙古沙冬青7 個部位進(jìn)行細(xì)胞毒活性測定,并檢測出有3 個部位有海蝦幼蟲致死活性,其中水層的海蝦幼蟲致死率顯著高于其他組分,由此可知蒙古沙冬青提取物水層是具有細(xì)胞毒活性的主要部位[15],這與理化檢識、薄層檢識的結(jié)果一致。此外,沙冬青對人體是否安全可靠,是否可以抗腫瘤尚不明確,將在今后研究中進(jìn)一步探索。