李霖楓,陳重華,李勝男,李天平

(1.四川大學華西藥學院,四川 成都 610041;2.四川大學華西醫(yī)院,四川 成都 610041)

升血小板膠囊是由國家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA) 批準的復方中藥制劑(國藥準字Z20025029),收載于《國家中成藥標準匯編內(nèi)科氣血津液分冊》[1],由青黛、牡丹皮、連翹、仙鶴草、甘草配伍而成,方中青黛功效清熱解毒、涼血消斑,為君藥；牡丹皮功效清熱涼血、活血化瘀,為臣藥,佐以止血健脾的仙鶴草、消腫散結(jié)的連翹,使以清熱解毒、調(diào)和諸藥的甘草,諸藥合用,共奏清熱解毒、涼血止血、散瘀消斑作用。臨床研究表明,該制劑對原發(fā)性血小板減少性紫癜有十分顯著的療效,常與激素類藥物聯(lián)用,總有效率達90%以上,未見嚴重不良反應和肝腎毒性,而且長期耐受、價格低廉、口服方便,臨床廣泛使用[2-4],但其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制尚不明確,缺少相關(guān)藥理作用的系統(tǒng)性探索。

中藥成分組成復雜,能同時作用于體內(nèi)多個靶點,通過多途徑、多層次、多機制發(fā)揮協(xié)同療效[5],但傳統(tǒng)藥物研究遵循“一藥、一靶、一病” 線性模式,難以有效地闡明中藥的治病機制。網(wǎng)絡藥理學將藥物研究模式轉(zhuǎn)變?yōu)椤岸喑煞?、多靶點、多疾病”[6],是探索中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、方劑配伍理論、藥理作用機制的新方法[7]。因此,本研究通過該方法探尋升血小板膠囊有效成分和作用靶點,通過靶蛋白互作、功能和通路富集(圖1) 系統(tǒng)地研究該制劑治療原發(fā)性血小板減少性紫癜的可能機制,為深入開展相關(guān)實驗及臨床研究提供參考。

圖1 升血小板膠囊作用機制研究的網(wǎng)絡藥理學流程圖

1 方法

1.1 成分篩選與靶點預測 通過TCMSP[8](http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、TCM Database@ Taiwan[9](http://tcm.cmu.edu.tw/) 等中草藥系統(tǒng)藥理平臺,以“青黛” “牡丹皮” “連翹” “仙鶴草” “甘草” 為關(guān)鍵詞檢索化學成分,結(jié)合相關(guān)文獻,收集整理各組分所含成分?？诜锢枚?Oral bioavailability,OB) 是指所給藥物進入人體循環(huán)的藥量比例,而類藥性(Drug-likeness,DL) 是指化合物與已知藥物的相似性,兩者共同反映化合物的成藥性。按照TCMSP 建議,通過該平臺自帶的條件篩選功能,以OB≥30%、DL≥0.18 為標準,篩選滿足條件的化合物。另外,不滿足上述條件但有文獻或數(shù)據(jù)支持、具有明確生物活性的化合物也確定為候選成分,以避免遺漏。再通過PubChem 數(shù)據(jù)庫 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),獲取候選成分的相關(guān)化學信息和PubChem CID。

Similarity ensemble approach[10](SEA)(http://sea.bkslab.org/) 是以化學結(jié)構(gòu)為核心、比較靶標相似性的一種藥物靶點預測方法,將候選成分的Canonical SMILES 導入該平臺,預測其潛在靶點,選擇“Homo sapiens”、Tc≥0.7[10-11]的靶點作為候選靶點,進行后續(xù)分析。再通過Uni-Prot 蛋白數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/),確認候選靶點的相關(guān)信息和UniProt ID。

1.2 成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建 通過Cytoscape3.7.1 軟件構(gòu)建候選成分與其預測靶點之間的互作網(wǎng)絡,節(jié)點(nodes) 表示中藥、化合物或靶點,邊(edges) 表示兩者之間的相互作用。在網(wǎng)絡中,度(degree) 是指一個節(jié)點的與其他節(jié)點的連接數(shù)量,度越大,該節(jié)點的直接相關(guān)節(jié)點越多,在網(wǎng)絡中越重要,故本研究根據(jù)候選成分該數(shù)值的大小來確定關(guān)鍵化合物。

1.3 靶蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡構(gòu)建 為了解靶蛋白之間的互作關(guān)系(protein-protein interaction,PPI),將所有靶蛋白導入String 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),物種選擇“Homo sapiens”,最低互作分數(shù)設為“medium confidence”,獲取PPI 數(shù)據(jù),再用Cytoscape3.7.1 構(gòu)建預測靶點互作網(wǎng)絡。在網(wǎng)絡中,度中心性(degree centrality,DC)、介數(shù)中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC) 是判斷節(jié)點關(guān)鍵程度的重要拓撲參數(shù),本研究通過Network Analyzer 計算網(wǎng)絡各個節(jié)點DC、BC、CC 以判斷節(jié)點重要性,再按照DC 進行節(jié)點排列作圖,圓點越大,顏色越亮,節(jié)點DC 越大。

1.4 GO 生物過程、KEGG 信號通路富集分析 通過String數(shù)據(jù)庫進行GO 生物過程、KEGG 信號通路富集分析,以FDR＜0.05 為限定值,對所得GO term、KEGG pathway 進行篩選。

2 結(jié)果

2.1 候選成分篩選 通過TCMSP、TCM Database@Taiwan及文獻檢索,以OB≥30%、DL≥0.18 或具有明確生物活性為篩選條件,共得到163 種候選成分。其中,青黛19 種,主要有 indirubin、indigo、qingdainone、tryptanthrin、quercetin 等(indirubin 為升血小板膠囊指標成分)；牡丹皮19 種,主要有paeoniflorin、benzoyl-paeoniflorin、paeonol、quercetin、kaempferol 等；連 翹40 種,主要有phillyrin、(-) -phillygenin、arctiin 等；仙鶴草23 種,主要有agrimol、agrimonolide、vitamin K1 等；甘草94 種,主要有l(wèi)iquiritigenin、glycyrol、glyasperin 等。升血小板膠囊含有大量生物堿、黃酮、有機酸、萜類、甾體類化合物,其中quercetin、isorhamnetin、β-sitosterol 為 5 種組方 藥材共 有成分,kaempferol、oleanic acid、caffeic acid 等13 個化合物在2 種以上中藥中同時存在。

2.2 候選成分潛在靶點預測 設定Tc≥0.7 為閾值,71 種候選成分預測出186 個靶點(其余92 種無滿足閾值的靶點)。其中,青黛12 種成分匹配到80 個靶點,牡丹皮12種成分匹配到93 個靶點,連翹29 種成分匹配到131 個靶點,仙鶴草16 種成分匹配到136 個靶點,甘草32 種成分匹配到123 個靶點。

2.3 候選成分-靶點網(wǎng)絡分析 將5 種組方藥材163 種候選成分、186 個潛在靶點導入Cytoscape3.7.1 中,構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡,結(jié)果見圖2,根據(jù)Network Analyzer 計算結(jié)果,網(wǎng)絡中含有354 個節(jié)點、744 條邊,其中549 條邊表示化合物與其潛在靶點之間的相互關(guān)系；在163 種候選成分中,有8 種度值大于20,分別是quercetin (66)、ellagic acid(43)、kaempferol (37)、myricetin (38)、luteolin (34)、apigenin (35)、isorhamnetin (26)、ferulic acid (23)；在186 個預測靶點中,有7 個度值較高,依次為CA7 (19)、CA4 (14)、CA12 (16)、AKR1B1 (13)、CA2 (11)、ABCG2 (11)、CYP1A2 (10)。由此說明,在升血小板膠囊候選成分-靶點網(wǎng)絡中,1 個化合物可作用于多個靶點,而1個靶點也可與多個化合物相互作用。

圖2 升血小板膠囊候選成分與潛在靶點網(wǎng)絡

2.4 靶蛋白互作網(wǎng)絡分析 通過String 平臺獲得186 個靶蛋白的互作關(guān)系,將數(shù)據(jù)文件導入cytoscape3.7.1,構(gòu)建PPI (圖3),由于有8 個靶蛋白未參與蛋白互作,故網(wǎng)絡中實際含178 個節(jié)點、1 520 條邊,可知具有較多相互關(guān)系的靶點 有AKT1、EGFR、TNF、SRC、HSP90AA1、ESR1、PTGS2、CCND1、MMP9、CREB1 等。根據(jù)計算結(jié)果,將DC、BC、CC 排名前20 的靶蛋白建立交集,得到AKT1、EGFR、TNF、SRC、HSP90AA1 等13 個三者數(shù)值均較高的潛在靶點(表1),在PPI 中均發(fā)揮關(guān)鍵作用,其中AKT1度值(87) 遠高于其余靶點,是PPI 網(wǎng)絡中連接其他節(jié)點的橋梁。

圖3 升血小板膠囊潛在靶蛋白互作網(wǎng)絡（按度中心性由大至小排序）

2.5 GO 生物過程富集分析 以FDR＜0.05 為標準,得到1 920條GO bio-progress term,主要有機體對化學物質(zhì)的反應,細胞信號轉(zhuǎn)導,蛋白質(zhì)的磷酸化,對酶活性、機體代謝及細胞凋亡的調(diào)控等。再按FDR 負對數(shù)值大小排序,排名前20 的GO term 見圖4,具體信息見表2。

表1 PPI 網(wǎng)絡關(guān)鍵靶點

圖4 GO 生物過程富集分析（排名前20）

表2 GO 生物過程富集信息（排名前20）

2.6 KEGG 通路富集分析 將186 個靶點通過String 平臺進行KEGG 通路富集分析,獲得159 條滿足FDR＜0.05 的信號通路,排名前20 的見圖5,具體信息見表3。根據(jù)KEGG pathway 數(shù)據(jù)庫分類標準,159 條信號通路可分為31類,其中癌癥通路24 條,包括前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌等；信號轉(zhuǎn)導通路20 條,包括PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、Rap1 信號通路等；感染性疾病通路19條,包括乙型肝炎、人乳頭病毒感染、麻疹等；內(nèi)分泌系統(tǒng)通路14 條,包括孕酮介導的卵母細胞成熟、內(nèi)分泌抵抗等；免疫系統(tǒng)通路13 條,包括B 細胞受體信號通路、T 細胞受體信號通路、Fc 受體介導的吞噬作用等。

原發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP) 與免疫相關(guān)通路關(guān)系密切,其中Fc 受體介導的吞噬作用是KEGG 數(shù)據(jù)庫列出的ITP 病因通路。升血小板膠囊可能通過調(diào)控免疫相關(guān)通路,干預DRD2、IL2、SYK、AKT1、PIK3R1 等靶點而發(fā)揮作用,還涉及多條癌癥相關(guān)通路(如前列腺癌、PI3K-Akt 信號通路),可能具有抗腫瘤潛力。

圖5 KEGG 通路富集分析（排名前20）

表3 KEGG 信號通路富集信息（排名前20）

3 討論

原發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP) 是由人體免疫功能失調(diào)所致的一種自身免疫性血液病,以血小板數(shù)量減少及壽命縮短、巨核細胞成熟障礙、皮膚黏膜、內(nèi)臟出血為特征[12-13],其發(fā)病機制與抗血小板自身抗體(PAlg) 介導的血小板過度破壞或生成不足有關(guān)[14]。升血小板膠囊具有清熱解毒、涼血止血、散瘀消斑的作用,臨床上多與激素、潑尼松、白介素11 或丙種球蛋白等藥物聯(lián)用,不僅能調(diào)節(jié)機體免疫功能,還可提高血小板數(shù)量,增強血小板聚集能力[15]。曹波[16]以其聯(lián)合重組人血小板生成素注射液治療特發(fā)性血小板減少性紫癜,發(fā)現(xiàn)血小板恢復時間加快,血清PAlgG 水平顯著下降,臨床總有效率高達91.18%；劉婧依等[17]聯(lián)合其和花生衣提取液治療原發(fā)性血小板減少性紫癜,發(fā)現(xiàn)外周血中CD8+明顯降低,CD4+都明顯升高,T 細胞亞群恢復正常,血小板數(shù)量增加；何牧卿等[18]以其和潑尼松對66 名免疫性血小板減少性紫癜患者進行治療,發(fā)現(xiàn)臨床療效顯著高于單用潑尼松,而且外周血CD4+CD25+Treg 細胞和IL10、TGF-β1血清水平均顯著升高,表明該制劑可通過調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg 細胞數(shù)量或功能來參與原發(fā)性血小板減少性紫癜發(fā)病進程。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學考察升血小板膠囊治療原發(fā)性血小板減少性紫癜的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制,從中獲得163種化學成分及186 個潛在作用靶點,其中槲皮素、鞣花酸、山柰酚、木犀草素、異鼠李素、β-谷甾醇等為關(guān)鍵化合物,AKT1、EGFR、TNF、SRC、HSP90AA1、PIK3R1 等13 個靶點為核心靶點。KEGG 信號通路富集結(jié)果顯示,升血小板膠囊參與多條免疫相關(guān)通路(如Fc 受體介導的吞噬作用、T 細胞受體信號通路) 和信號轉(zhuǎn)導通路 (如PI3K-Akt、MAPK 信號通路),并與PI3K-Akt 信號通路關(guān)聯(lián)度最高,涉及潛在靶點28 個,其中SRC、PIK3R1、AKT1、CREB1、HSP90AA1、SYK 等均為PPI 網(wǎng)絡重要靶點。由此推測,升血小板膠囊治療原發(fā)性血小板減少性紫癜的作用機制可能是(1) 阻止血小板抗體-抗原復合物與巨噬細胞膜表面的Fc 受體識別并結(jié)合,避免酪氨酸激酶活化而激活下游信號通路,防止肌動蛋白聚合和吞噬體形成,減弱巨噬細胞對血小板的吞噬作用,最終使血小板數(shù)量回升；(2) 通過干預PI3K-Akt-mTOR 通路來調(diào)控B 細胞和T 細胞的增殖、凋亡、分化[19-20],減少抗血小板自身抗體的產(chǎn)生 (如PAlgG),促進T 細胞亞群數(shù)量與功能的平衡(如Th 細胞、Tc 細胞、Treg 細胞),影響相關(guān)細胞因子分泌(如IL-2、IL-10、TGF-β1),與已有文獻資料基本吻合,可為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。

由于PI3K-AKT 信號通路與腫瘤細胞的增殖、存活、凋亡及遷移等有關(guān)[21],故結(jié)合靶點預測和通路富集結(jié)果,本研究認為升血小板膠囊還可能通過調(diào)控PI3K-Akt 信號通路來發(fā)揮抗腫瘤作用,與其臨床應用和文獻資料基本契合。首先,升血小板膠囊臨床上用于治療原發(fā)性血小板減少性紫癜時,可調(diào)節(jié)免疫細胞數(shù)量與功能平衡,干預細胞免疫和體液免疫,故理論上可通過調(diào)節(jié)機體免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用。其次,該制劑含有大量抗腫瘤活性物質(zhì),如青黛以靛玉紅、靛藍、青黛酮、色胺酮為主要成分,具有抗菌、抗炎、抗癌等作用和免疫調(diào)節(jié)功能,其中靛玉紅抗腫瘤活性顯著,能抑制多種癌細胞增殖[22-23]；丹皮酚是牡丹皮主要藥效成分,可通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用[24]；仙鶴草具有黃酮、有機酸、三萜等活性化合物,廣泛用于防治腫瘤,在多數(shù)處方中超劑量使用[25]；連翹、甘草可調(diào)節(jié)機體免疫功能[26-27]。但目前尚無關(guān)于升血小板膠囊治療腫瘤的報道,方中5 種中藥配伍使用是否具有上述功效仍需要通過進一步實驗進行驗證。