李春楠,呂經(jīng)緯,高 旭,高曉晨,張凱月,孫佳明,張 輝

(長春中醫(yī)藥大學,吉林省人參科學研究院,吉林 長春 130117)

十味香鹿膠囊是獲得國家專利的上市新藥(國藥準字Z20120003),由人參、鹿角托盤、薤白、天冬、香附、桔梗、蜈蚣、莪術、浙貝母、鱉甲10 味中藥組成,具有疏肝解郁、理氣化痰、軟堅散結、扶正去邪等功效,對肝氣郁滯、痰凝氣結所致乳腺增生、乳房脹痛有良好療效[1-2]。同時,方中人參皂苷[3]、鹿角托盤總肽[4]等成分可治療腫瘤,使得該復方治療乳腺癌上也有很好的作用。

乳腺癌是女性惡性腫瘤發(fā)生第一位的疾病,發(fā)病率和死亡率均呈持續(xù)上升的趨勢[5],如何從根本上治療仍是難以攻克的問題,其病因不明確,無確切預防措施,而且對于晚期病情缺少有效根除方法。目前,治療該疾病基本靠手術和化療,但對患者傷害較大,故研發(fā)一種不良反應小、療效強的中藥新藥是非常有意義的。

網(wǎng)絡藥理學是近年來興起的一種綜合系統(tǒng)生物學、藥理學等多學科的研究方法,其科學性、可靠性、與中醫(yī)藥理論匹配性均已經(jīng)被許多學者證實[6],可從多方向、多層次對中藥復方進行分析,完全符合其多成分、多靶點、多通路的特點,通過構建“活性成分-疾病靶點-疾病通路” 網(wǎng)絡,可清晰明了地分析其針對疾病的作用靶點及通路。因此,本研究采用網(wǎng)絡藥理學探究十味香鹿膠囊治療乳腺癌的作用機制,以期為該復方基礎研究和臨床應用提供科學依據(jù)。

1 方法

1.1 化學成分收集和篩選 通過TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/) 中藥數(shù)據(jù)庫檢索十味香鹿膠囊中10 味中藥(人參、桔梗、香附、天冬、薤白、蜈蚣、莪術、浙貝母、鹿角托盤、鱉甲) 所有化學成分。在篩選階段,TCMSP 數(shù)據(jù)應用口服生物利用度 (OB)、類藥性(DL) 篩選,閾值分別為OB≥30%,DL≥0.18；BATMANTCM 的數(shù)據(jù)由分數(shù)(Score) 和P 值(P Value) 篩選,閾值分別為score≥30、P≤0.05。

1.2 化學成分作用靶點預測 篩選出的有效成分在美國國立生物技術信息中心 (NCBI,https://w-ww.ncbi.nlm.nih.gov/) 查詢相應SMILES 號,通過SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)、SEA (http://sea.bkslab.org/)、Drugbank (https://www.drugbank.ca/) 進行成分-靶點預測,再收集TCMSP 上給出的預測靶點,將4 個數(shù)據(jù)庫中的成分-靶點合并、篩重,確定復方中所有成分預測的靶點。

1.3 疾病相關靶收集點 采用TTD (https://db.idrblab.org/ttd/)、DisGeNET (http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home)、Drugbank 等數(shù)據(jù)庫,收集與乳腺癌相關的靶點。

1.4 治療乳腺癌活性成分與靶點篩選 將前期檢索的化學成分預測靶點、疾病靶點導入Uniprot (https://www.uniprot.org/) 中,考察范圍定位到人類,最后轉化成對應的Uniprot ID、基因名稱。以Uniprot 號為橋梁,將復方中所有成分預測靶點與疾病對應靶點進行合并,查找重復項,交集,最終確定治療乳腺癌的核心靶點和活性成分,并查找相應藥材的歸屬。

1.5 GO 生物功能分析、KEGG 通路富集 通過Cytoscape3.7.1 軟件中的ClueGo 插件對核心靶點進行GO 功能富集(P≤0.01),分析藥物作用靶點的生物學過程,闡明復方中化合物靶點蛋白在基因功能中的作用。將核心靶點導入Metascape 數(shù)據(jù)庫 (http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1),選擇KEGG 通路,物種設置為人,進行通路富集分析,闡明核心靶點在信號通路中的作用,得到抗乳腺癌主要作用通路及對應靶點。

1.6 “中藥-成分-疾病靶點-通路” 網(wǎng)絡圖構建 將10 味中藥、活性成分、核心靶點、KEGG 通路分別導入Cytoscape3.7.1 軟件中,以四者為節(jié)點,選用Merge 功能,它們之間有相互關系的分別用邊相連,構建“中藥-成分-疾病靶點-通路” 網(wǎng)絡,點擊網(wǎng)絡分析對其進行拓撲參數(shù)分析。

1.7 分子對接進行靶點驗證 通過Systems Dock 在線分子對接網(wǎng)站 (http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index) 將Degree 值較高的關鍵靶點和活性成分進行分子對接,用于闡明配體如何作用于復雜的分子網(wǎng)絡,驗證靶點蛋白與化學分子結構的關系。然后,在該網(wǎng)站按照Step1-4里要求,將排名靠前的靶點與活性成分輸入網(wǎng)站,進行分子對接,得到docking score 和分子對接可視圖。

2 結果

2.1 活性成分收集和篩選 十味香鹿膠囊活性成分共793種,其中人參293 種、桔梗105 種、香附104 種、天冬32種、薤白87 種、蜈蚣8 種、莪術81 種、浙貝母44 種、鹿角托盤16 種、鱉甲23 種。經(jīng)篩重后,最終得到253 種符合條件者,其中人參119 種、桔梗21 種、香附30 種、天冬8 種、薤白23 種、蜈蚣5 種、莪術6 種、浙貝母6 種、鹿角托盤16 種、鱉甲19 種。

2.2 成分預測靶點 十味香鹿膠囊有效成分對應的靶點共8 156 個,其中人參2 414 個、桔梗449 個、浙貝母401 個、莪術243 個、香附1 368 個、薤白885 個、天冬788 個、蜈蚣114 個、鹿角托盤724 個、鱉甲770 個,經(jīng)合并篩重后,最終得到1 406 個不重復的。

2.3 疾病靶點篩選 經(jīng)篩重后,得到十味香鹿膠囊中有100 個疾病靶點。

2.4 疾病核心靶點與活性成分 十味香鹿膠囊與乳腺癌交集的核心靶點共43 個,登陸DisGeNET 網(wǎng)站,輸入Uniprot查找其蛋白歸屬,見表1,復方中治療乳腺癌的活性成分共110 種,見表2。

2.5 GO 功能富集分析 將43 個核心靶點輸入Cytoscape 3.7.1 軟件中的ClueGO 插件,得到8 個生物學過程,分別為磷脂酰肌醇介導的信號傳導過程(phosphatidylinositolmediated signaling)、細胞衰老過程(cell aging)、調節(jié)有絲分裂細胞周期的G1/S 轉換過程 (regulation of G1/S transition of mitotic cell cycle)、前列腺增長過程(prostate gland growth)、前列腺 發(fā)展過 程 (prostate gland development)、磷脂酰肌醇3-激酶信號的調控(regulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling)、器官生 長過程(organ growth)、干細胞增殖的正向調控過程(positive regulation of stem cell proliferation),見圖1。另外,通過ClueGo功能分析生物學過程互作網(wǎng)絡可發(fā)現(xiàn)生物過程之間的相互作用關系,圖2 顯示不同生物過程的相互作用,不同顏色代表不同生物過程,節(jié)點的大小代表調控的強弱,節(jié)點間的連線代表相互作用,其中positive regulation of stem cell proliferation 生物學過程在治療乳腺癌中是獨立的。

圖1 ClueGo 功能分析生物學過程

2.6 KEGG 通路分析 得到EGFR 酪氨酸激酶抑制通路(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、微小RNA 癌癥通路(MicroRNAs in cancer)、P53 信號通路(P53 signaling pathway) 等9 大類通路,見圖3。另外,還發(fā)現(xiàn)癌癥通路(Pathways in cancer)、PI3K-Aktsignaling 通路(PI3K-Aktsignaling pathway)、蛋白聚糖癌癥通路(Proteoglycans in cancer)、MicroRNAs in cancer、EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance 等76 條KEGG 通路及其對應的靶點。

表1 十味香鹿膠囊治療乳腺癌的核心靶點信息

表2 十味香鹿膠囊治療乳腺癌的活性成分及藥材歸屬

圖2 ClueGo 功能分析生物學過程互作網(wǎng)絡

圖3 KEGG 通路富集分析

2.7 “中藥-成分-疾病靶點-通路” 網(wǎng)絡圖 網(wǎng)絡圖見圖4,共有239 個節(jié)點、842 個邊,平均Degree 為7.046 (該值是表示與該節(jié)點相連的邊的條數(shù),節(jié)點度越高,其參與的生物過程越多),大于等于7.046 的有51 個,其介數(shù)(Betweenness Centrality)、接近中心性 (Closeness Centrality)、平均最 短路徑長度 (AverageShortest PathLength) 表明了其重要性,網(wǎng)絡拓撲參數(shù)見表3。由此可知,相同成分可對應1 個或多個靶點,而不同成分又可作用于同一靶點,具有協(xié)同作用。

在活性成分方面,大于平均Degree 值的活性成分有11種,其中槲皮素、木犀草素、山柰酚、刺槐素等Degree＞10的排在前4,分別對應28、15、12、12 個度,表明成分對應了多個中藥和靶點。靶點是鏈接成分和通路的關鍵,大于平均Degree 值的有23 個,大于30 的分別為AKT1、PIK3CA、ESR1、AR、PGR、TP53、EGFR,對應的活性成分和通路較多,可能是十味香鹿膠囊治療乳腺癌的重要靶點。在通路方面,對應靶點大于平均Degree 值的有12 個,其中Pathways in cancer、Proteoglycans in cance、PI3K-Akt signaling pathway、EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance、MicroRNAs in cancer 比較重要。

2.8 分子對接 選擇槲皮素、木犀草素、山柰酚、刺槐素活性成分,以及AKT1、PIK3CA、ESR1、AR 關鍵靶點,輸入Systems Dock 在線分子對接網(wǎng)站,由于PIK3CA、AR在數(shù)據(jù)庫無蛋白結構,故只以AKT1、ESR1 為驗證靶點,結果見圖5,可知槲皮素、山柰酚、木犀草素score 值均高于天然配體的分值,而刺槐素score 值較低。槲皮素、山柰酚、木犀草素活性成分與上述靶點的3D、2D 對接圖見圖6～7,進一步證明了它們與靶點的結合性較強,可起到較好的治療作用。

3 討論

網(wǎng)絡藥理學是通過檢索大數(shù)據(jù)來對藥物進行化合物、靶點、通路、代謝物等多種指標進行分析的新模式,其整體性、系統(tǒng)性、動態(tài)性的特點與中醫(yī)整體觀念、辨證論治的理論相一致[7]。十味香鹿膠囊可用于治療肝氣郁滯、痰凝氣結所致乳腺增生、乳房脹痛等疾病,近年臨床發(fā)現(xiàn)該復方還有抗乳腺癌的功效,故本研究采用網(wǎng)絡藥理學對其活性和機制進行探討,可為更好地研發(fā)相關新藥提供思路。

圖4 中藥-成分-疾病靶點-通路網(wǎng)絡圖

圖5 槲皮素、木犀草素、山柰酚、刺槐素活性成分與AKT1、ESR1 靶點的分子對接值

十味香鹿膠囊具有多成分、多靶點、復雜性等特點,在檢索全方成分數(shù)據(jù)庫時發(fā)現(xiàn),鹿角托盤、蜈蚣、鱉甲等動物藥涉及較少,表明網(wǎng)絡藥理學對該類成分的研究具有一定局限性。網(wǎng)絡圖分析顯示,方中Degree 排名前5 的活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、刺槐素、β-谷甾醇可直接作用到AKT1、AR、ESR1、PIK3CG、TP53、VEGFA等關鍵靶點,其中槲皮素是桔梗、香附、薤白、天冬有效成分,具有較好的抑制細胞增殖作用,王根進等[8]發(fā)現(xiàn)它能通過抑制EGFR/AKT、mTOR 信號通路來促進人乳腺癌細胞株T47D 的細胞凋亡過程,促進T47D 細胞的Bax、caspase3、caspase9 凋亡蛋白及mRNA 水平增加；木犀草素是桔梗、香附有效成分,Lee、彭鈺芳等[9-10]報道它在一定濃度下(＜100 μmol/L) 能顯著抑制乳腺癌細胞MDAMB-231 增殖,并可降低細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子P21 表達,從而使細胞周期停滯在G2/M 期和S 期；刺槐素是桔梗中的成分,能對應多個靶點,具有雌激素樣作用,在0.001～10 μmol/L 范圍內可通過調節(jié)ERα 受體表達來促進T47D 細胞的增殖[11]；山柰酚是人參、香附中的成分,具有抗癌、消炎作用,能抑制人乳腺癌細胞、肝癌細胞、大鼠嗜堿性白血病細胞等多種癌癥,可直接作用到P53、Bax 等凋亡蛋白[12-14]；β-谷甾醇是人參、天冬、香附、薤白、貝母共有成分,可作用 到AR、BCL2、CYP19A1、ESR1 等核心靶點,對T47D 乳腺癌細胞有抑制作用[15]。此外,十味香鹿膠囊中有51 種活性成分作用AR 靶點,52 種作用ESR1 靶點,41 種作用PGR 靶點,證明全方活性成分具有協(xié)同作用。

表3 網(wǎng)絡拓撲參數(shù)（Degree＞7.046）

圖7 槲皮素、山柰酚、木犀草素活性成分與AKT1、ESR1 靶點的分子對接2D 圖

同時,拓撲參數(shù)中 AKT1、PIK3CA、ESR1、AR、PGR、TP53、EGFR 靶點的Degree＞30,表明它們是核心靶點中較為關鍵重要的,在乳腺癌治療過程中參與較多,生物學重要性較大。其中,蛋白激酶B (AKT1) 和磷脂酰肌醇3 激酶(PIK3) 是PI3K-Akt 信號通路中的關鍵靶點,通過激活下游分子在細胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮作用,是治療癌癥中常見的靶蛋白；ESR1 是雌激素受體α,具有調節(jié)雌激素作用,雌激素通過與其結合來發(fā)揮抗癌作用[16]；AR 是雄性激素受體,在乳腺癌發(fā)生過程中起著重要作用,與HER-2 信號通路可交叉調節(jié),AG825 抑制劑和抗雄激素藥物可負調節(jié)兩者表達,從而抑制細胞增殖和腫瘤生長[17-18]；PGR 是孕激素受體,其表達缺失是激素敏感性乳腺癌預后不良的原因,同時它也是ER 信號轉導通路的下游基因產(chǎn)物對治療乳腺癌起著重要作用[19]；P53 凋亡蛋白在PI3K-Aktsignaling pathway、Pathways in cancer 里都起著重要作用[20],其誘導的miRNA 也可抑制細胞周期調控因子或抗凋亡相關蛋白表達,進而調控細胞周期和細胞存活[21]；表皮生長因子受體(EGFR) 是腫瘤學研究中常用的分子標記物,在多種惡性腫瘤的癌變、進展過程中有重要作用,有研究者認為其表達升高與腫瘤內血管生成、細胞凋亡障礙有關,可作為惡性腫瘤預后不佳的預測因子及靶向治療的靶點,同時其信號通路也是細胞凋亡的重要通路[22],與乳腺癌的多個病理生物學指標[如淋巴結轉移情況、TNM 分期、雌激素受體 (ESR1)、孕激素受體(PGR) 等]存在相關性,在病情進展中起著重要作用,也可作為參考指標對疾病的轉歸和預后；ESR1 可特異性結合雌激素,激活SRC-Ras-PI3K-Akt、MAPK/ERK 等下游通路,參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展,而AR 與其信號通路共同作用于同一個細胞的,前者通過干擾后者與靶基因的結合,阻斷后者對靶基因的激活,抑制下游的細胞增殖信號通路,從而起到抑制乳腺上皮細胞增殖的作用,并且還可通過生長因子絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信號通路參與乳腺的發(fā)育,進而調節(jié)乳腺癌細胞增殖[23]；Luo 等[24-25]發(fā)現(xiàn),治療乳腺癌的藥物可激活腫瘤相關成纖維細胞中的雌激素G 蛋白偶聯(lián)受體(GPER),可通過EGFR 通路促進細胞生長和遷移,還能促進芳香化酶基因(CYP19A1) 表達和E2合成,這些效應可能會影響腫瘤細胞生物學行為[26]。

另外,MicroRNAs 是一類參與調節(jié)細胞的分化增殖凋亡等多種生物學進程[27-28],涉及多個基因及信號傳遞網(wǎng)絡,對乳腺癌有影響,它可調控ESR1 表達,特別是直接靶向調控,可促進乳腺癌發(fā)生。例如,MiR-206 參與EGFR介導的乳腺癌向ERα 陰性、Basal-like 型轉變過程[29],EGFR 信號可增加miR-206 水平,起到抑制SRC-1、AIB1、GATA-3 的作用,進而抑制ERα 信號通路,促進細胞凋亡,降低多個雌激素反應性基因的表達[30]。

綜上所述,十味香鹿膠囊中有多種活性成分作用于同一靶點,也有同一活性成分作用于多個靶點；有多個靶點對應同一通路,也有同一靶點對應多條通路,表明該復方是通過多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用來治療乳腺癌的。雖然方中鹿角托盤、蜈蚣等動物藥數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)檢索受限,但通過靶點、通路預測及臨床報道,仍可其所含活性成分可直接作用于AKT、EGFR、P53 等重要靶點,從而起到相關療效。因此,對十味香鹿膠囊所預測的活性成分及核心靶點可作為今后研究重點,為該復方藥效及臨床研究提供理論和實驗依據(jù)。