李慶耀,晏 雯,褚洪標(biāo),周細(xì)根,羅 婷,顏峰光,梁生林

(井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部,江西 吉安 343009)

白術(shù)為菊科蒼術(shù)屬植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖,其性溫,味甘、苦,歸脾、胃經(jīng),具有健脾益氣功效,中醫(yī)臨床常用其治療脾胃氣虛、運(yùn)化乏力[1]。馬曉松等[2]研究顯示,白術(shù)煎劑可顯著促進(jìn)動物離體回腸收縮、在體胃排空、腸推進(jìn)運(yùn)動；朱金照等[3]對15種理氣中藥進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)白術(shù)促胃腸動力作用非常突出,可與臨床常用的西藥媲美,但其促胃腸動力的活性部位和物質(zhì)基礎(chǔ)不清楚。

丁曙晴等[4]研究表明,白術(shù)水煎劑可明顯增強(qiáng)體外結(jié)腸收縮,而其石油醚、乙醇提取物卻未見收縮活性,推測其水溶性部分可能具有促進(jìn)腸道動力作用；課題組前期離體實(shí)驗(yàn)也初步證實(shí),在白術(shù)水提液萃取后的乙酸乙酯、正丁醇、水層中,只有水層具有明顯的促進(jìn)腸收縮作用。因此,本實(shí)驗(yàn)將考察白術(shù)水溶性部位及其洗脫組分對離體腸平滑肌收縮及整體胃排空、腸推進(jìn)的影響,以期進(jìn)一步追蹤和評價該藥材促胃腸動力的活性物質(zhì)。

1 材料

1.1 動物 清潔級昆明種小鼠,雄性,體質(zhì)量(20±2) g,由湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXX (湘) 2013-0004,飼養(yǎng)于(23±1)℃恒溫、每12 h規(guī)律/暗交替的環(huán)境中,自由飲水和進(jìn)食,實(shí)驗(yàn)前至少需要5 d 的適應(yīng)環(huán)境時間。中國白兔,雌雄不拘,體質(zhì)量(2.0±0.5) kg,由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK (贛) 2014-0005。

1.2 試劑與藥物 D101 大孔吸附樹脂,購自河北滄州寶恩材料有限公司。莫沙比利片,購自成都康弘藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號10 030197；其他試劑均為分析純。炒白術(shù)購自吉安市百姓大藥房,經(jīng)專家鑒定為菊科蒼術(shù)屬白術(shù)Rhizoma Atractylodis macrocephalae,再制備其水溶性部位及洗脫組分。參考Kitajima 等[5]報(bào)道的方法,取已干燥至恒重的白術(shù)500 g,粉碎后加入8 倍量蒸餾水煎煮3 次,每次1.0 h,濾過,合并3 次濾液,加熱濃縮至1 000 mL,乙酸乙酯萃取3 次,萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干回收溶劑,溶于600 mL 水中,即得水溶性部位,取經(jīng)預(yù)處理的D101大孔樹脂500 g,裝入層析柱中至柱高為85 cm,取300 mL水層,蒸餾水稀釋至500 mL 后以1 mL/min 體積流量經(jīng)大孔樹脂柱吸附,依次用水及20%、40%、60%、80%乙醇洗脫,洗脫體積為1 000 mL,洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸儀減壓蒸干回收溶劑,30 mL 蒸餾水溶解,即得未吸附物、水洗脫物及20%、40%、60%、80%乙醇洗脫組分。

1.3 儀器 R-200 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,購自瑞士步琪公司；RM6240 型微機(jī)生物信號采集處理系統(tǒng),購自成都儀器廠；FA1 604 N 電子天平,購自上海精密科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2.1 離體家兔回腸自發(fā)收縮張力測定 參照馬曉松等[2]報(bào)道的方法,并略加改動。取禁食12 h 的家兔,擊昏后立即打開腹腔,找到回盲部,距其15 cm 處剪取一段回腸,置于盛有臺氏液并通氧的培養(yǎng)皿中,注射器沖洗腸管后剪去腸系膜。取一段長約1.5 cm 的回腸,腸管兩端對角穿線結(jié)扎后一端固定在麥?zhǔn)显〔鄣撞康你^子上,另一端系在張力換能器上,后者與RM6240 微機(jī)生物信號采集處理系統(tǒng)相連,麥?zhǔn)显〔凼⒂?0 mL Tyrode’ s 液,溫度37 ℃。并持續(xù)通氧,腸管初始張力負(fù)荷為1.0 g,穩(wěn)定1 h 后開始記錄給藥前后回腸收縮曲線。每個組分按累積濃度加入,每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用臺氏液沖洗3 次,間隔30 min,按未吸附物、水洗脫物及20%、40%、60%、80% 乙醇洗脫組分的順序依次給藥,它們對回腸收縮的影響以收縮率表示,公式為收縮率=(給藥后最大收縮張力/給藥前最大收縮張力) ×100%。

2.2 小鼠胃排空率、小腸推進(jìn)率測定 參照王賀玲等[6]報(bào)道的方法。將小鼠隨機(jī)分為對照組(蒸餾水),水溶性部位高、低劑量組,洗脫組分高、低劑量組,陽性組(莫沙必利),每組12 只,灌胃給藥,劑量為0.1 mL/10 g,連續(xù)5 d。第4 天開始,小鼠禁食不禁水24 h,于第5 天禁水2 h后灌胃給予0.5 mL 營養(yǎng)半固體糊(2.5 g 羧甲基纖維素加到60 mL 水中充分溶解,再加入奶粉4 g、糖2 g、淀粉2 g、碳素墨水1 mL,每加1 次攪拌均勻,配成75 mL 糊狀物),15 min 后脫頸處死,剖開腹腔,結(jié)扎胃賁門、幽門后,迅速從賁門處至回腸末端分離胃腸,置于白色實(shí)驗(yàn)臺上,小腸自然拉直鋪平。首先,測量幽門至半固體糊前沿、幽門至盲腸部全長的距離,小腸推進(jìn)率=(幽門至半固體糊前沿的距離/幽門至盲腸部全長的距離) ×100%,再剪下胃,稱定全質(zhì)量,沿胃大彎剪開胃體,洗去胃內(nèi)容物后拭干,稱定凈質(zhì)量,半固體糊胃內(nèi)殘余量=胃全質(zhì)量-胃凈質(zhì)量,胃排空率=(1-半固體糊胃內(nèi)殘留量/半固體糊質(zhì)量) ×100%。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 13.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以() 表示,組間比較采用t 檢驗(yàn),組內(nèi)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)成組資料的方差分析。 P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 白術(shù)水溶性部位及其洗脫組分對離體家兔回腸自發(fā)收縮的影響 隨著質(zhì)量濃度增加(5.0、12.5、25.0、50.0 mg/mL),水溶性部位對回腸自發(fā)收縮的興奮效應(yīng)逐漸增強(qiáng),收縮率分別為114.0%、131.4%、156.1%、164.0%,與給藥前比較均有顯著差異(P＜0.01),并呈現(xiàn)出良好的量 效關(guān)系,其 中 25.0 mg/mL 與 12.5 mg/mL 比 較,50.0 mg/mL與25.0 mg/mL 比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),見圖1。另外,水溶性部位40%乙醇洗脫組分對離體腸收縮的促進(jìn)作用最強(qiáng),60% 乙醇洗脫組分次之,最大收縮張力均大于給藥前(P＜0.01),見表1。因此,選擇40%乙醇洗脫組分進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 離體家兔回腸自發(fā)收縮的量效曲線

表1 白術(shù)水溶性部位的洗脫組分對離體家兔回腸收縮的影響（，n=6）

表1 白術(shù)水溶性部位的洗脫組分對離體家兔回腸收縮的影響（，n=6）

注:與給藥前最大收縮張力比較,**P＜0.01。

3.2 白術(shù)水溶性部位及其40%乙醇洗脫組分對小鼠胃排空、腸推進(jìn)的影響 與對照組比較,水溶性部位高、低劑量組及40% 乙醇洗脫組分高劑量組小鼠小腸推進(jìn)率升高(P＜0.05,P＜0.01)；胃排空率有所增加,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見圖2。

4 討論

圖2 白術(shù)水溶性部位及其40%乙醇洗脫組分對小鼠胃排空、腸推進(jìn)的影響（，n=6）

功能性胃腸病在臨床上非常常見,主要包括功能性消化不良、腸易激綜合征,動力障礙、內(nèi)臟高敏性是其病理生理特征,表現(xiàn)為胃排空延遲和腸傳輸減慢[7],并且腹部手術(shù)后腸梗阻表現(xiàn)為胃腸內(nèi)容物傳輸減慢、食物不耐受、脹氣[8]。胃腸動力障礙臨床上常用促胃腸動力藥治療,但存在療效不佳、不良反應(yīng)嚴(yán)重的問題[9],故研發(fā)相關(guān)新型藥物具有重要意義。中醫(yī)擅長調(diào)理脾胃功能,而白術(shù)又是健脾補(bǔ)氣要藥,故很多臨床研究報(bào)道其大劑量用于治療慢性傳輸障礙性便秘[10-11],以其為組方藥材的枳術(shù)丸導(dǎo)滯消痞,用于治療功能性消化不良[12],均安全有效。鑒于此,有必要確定白術(shù)促胃腸動力作用的活性部位和物質(zhì)基礎(chǔ),而不僅僅是停留在粗提物層次上。

目前活性追蹤是中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的有效方法[13],本實(shí)驗(yàn)先用乙酸乙酯萃取白術(shù)水提液取后得到水溶性部位,再用D101 大孔樹脂對其進(jìn)一步分離,得到相應(yīng)洗脫組分。通過離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),白術(shù)水溶性部位促進(jìn)離體回腸收縮時呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系,最大收縮率達(dá)到164%,而且40%乙醇洗脫物促進(jìn)作用最強(qiáng),其收縮率達(dá)128.2%,大劑量下小腸推進(jìn)率均高于莫沙必利；但其促正常胃排空作用均不顯著,與朱金照等[3]報(bào)道的結(jié)果不同,可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)采用的是半固體營養(yǎng)糊法測定胃殘留率,而文獻(xiàn)采用的是葡聚糖藍(lán)-2000 溶液。鄭天珍等[14]發(fā)現(xiàn),白術(shù)對大鼠離體胃底肌條有較強(qiáng)的興奮作用,而胃頭區(qū)的收縮活動是液體食物排空的主要動力,故白術(shù)可能主要促進(jìn)液體的胃排空。綜合前期臨床報(bào)道和實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提示白術(shù)提取物主要興奮腸平滑肌,包括小腸、結(jié)腸,與臨床上該藥材多用于腸道傳輸性功能障礙相吻合,而治療功能性消化不良時,由于該疾病主要影響上胃腸道,尤其是胃的排空和容受受損,故需配伍枳實(shí)。

白術(shù)水溶性成分包括苷類、氨基酸、多糖等成分[1],Kitajima 等[15]采用Amberlite XAD-Ⅱ大孔樹脂柱分離得到其甲醇洗脫組分,從中鑒定出9 個糖苷,包括倍半萜糖苷(主要為蒼術(shù)苷A)、芳香族化合物糖苷(主要為淫羊藿次苷F2)、香豆素糖苷 [主要為莨菪亭-β-D-吡喃木糖基-(1→6) -β-D-葡萄糖苷]等。白術(shù)多糖無親脂基團(tuán),不被非極性大孔樹脂吸附,本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)其未吸附物和水洗脫物含有大量甜味成分,這些成分在離體實(shí)驗(yàn)中無促腸收縮作用,可能不是活性物質(zhì)。今后,將研究白術(shù)水溶性部位40%乙醇洗脫物主要成分,并在整體動物評價其促胃腸動力作用。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)證明白術(shù)水溶性部位及其洗脫組分具有良好的促腸動力作用,糖苷可能是其活性成分,對其進(jìn)一步研究時有望開發(fā)出治療腸運(yùn)動或傳輸障礙性疾病的新藥。