馬 靜,郭詩(shī)韻,馮程程,盧 軍,馬 麗*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科,新疆 烏魯木齊 830000;2.新疆醫(yī)科大學(xué),新疆 烏魯木齊 830000;3.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部,新疆 烏魯木齊 830000)

糖尿病腎病是糖尿病進(jìn)展到后期出現(xiàn)的一種嚴(yán)重并發(fā)癥,是導(dǎo)致終末期腎病的重要原因[1],可增加高血壓發(fā)生率和心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),并造成嚴(yán)重的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2-3]。該疾病發(fā)生因素是多方面的,不僅包括高糖條件下醛糖還原酶、多元醇代謝、蛋白激酶C 通路的激活等,還與固有免疫與慢性炎癥反應(yīng)[4]有關(guān),其中固有免疫系統(tǒng)TLRs 通過(guò)激活NF-κB 信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)炎性反應(yīng)[5],激活免疫細(xì)胞,分泌炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子參與病情發(fā)生發(fā)展。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),TLR4 通過(guò)固有免疫、炎癥、足細(xì)胞損傷、腎纖維化等幾個(gè)關(guān)鍵方面介導(dǎo)糖尿病腎病發(fā)展[6],那么同樣作為T(mén)LRs 家族的Toll 樣受體-5 (TLR5) 也有可能是相關(guān)靶點(diǎn)。

糖腎灌腸方在新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科臨床使用近20 年,可應(yīng)用于糖尿病腎病的各臨床分期,具有改善腰膝酸困、乏力、面色晦暗、肢體浮腫、惡心、納差等癥狀,對(duì)微量蛋白尿期向臨床蛋白尿期的進(jìn)展可明確干預(yù)。前期研究表明,該方可降低糖尿病腎病患者血同型半胱氨酸、內(nèi)皮素水平,明確了其確切作用機(jī)制之一[7],而在應(yīng)用腸道途徑延緩病程方面,不僅可降低上述2 種因子水平,還能降低尿蛋白、尿素、肌酐水平,調(diào)節(jié)血糖、血壓,改善臨床癥狀[8]。由于炎癥是糖尿病腎病發(fā)病的重要機(jī)制之一,故本實(shí)驗(yàn)考察糖腎灌腸方聯(lián)合替米沙坦是否可改善炎癥,從而影響糖尿病腎病的進(jìn)展。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)昆明種小鼠58 只,雌雄各半,6 周齡,體質(zhì)量(20±2) g,由新疆維吾爾自治區(qū)疾控中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK (新) 2016-0003。

1.2 藥物 糖腎灌腸方組方藥材生大黃30 g (產(chǎn)地甘肅,批號(hào)170504)、煅牡蠣50 g (產(chǎn)地山東,批號(hào)171101)、澤瀉30 g (產(chǎn)地四川,批號(hào)171003)、丹參15 g (產(chǎn)地山東,批號(hào)171005)、槐花30 g (產(chǎn)地河北,批號(hào)17060)、黑順片15 g (產(chǎn)地四川,批號(hào)171002)、黃芩30 g (產(chǎn)地甘肅,批號(hào)171006) 均由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院藥劑科提供,統(tǒng)一煎煮后由藥理室研究人員制成浸膏。替米沙坦片(上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司,批號(hào)J20150084)。

1.3 試劑 鏈脲佐菌素(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)614J031)；考馬斯亮藍(lán)貯備液(南京建成生物工程研究所)；拜安捷2 代血糖測(cè)定儀(上海健臻醫(yī)療科技有限責(zé)任公司)；抗TLR5 兔多抗(武漢Bio-Swamp 公司,批號(hào)PAB43755)；抗β-actin 抗體(批號(hào)ab8226)、鼠抗兔-HRP抗體(批號(hào)ab9484) (英國(guó)Abcam 公司)。

2 方法

2.1 模型建立 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后,取10 只作為正常組,喂食基礎(chǔ)飼料；其余小鼠均喂食高糖高脂飼料,4 周后,鏈脲佐菌素分別以60、90 mg/kg 劑量腹腔注射2次。4 d 后,小鼠斷尾取血,測(cè)定尾靜脈血糖值,以≥11.1 mmol/L 為糖尿病建模成功標(biāo)準(zhǔn),繼續(xù)喂食高糖高脂飼料6周后收集尿液,測(cè)定尿微量白蛋白表達(dá),以＞30 mg/dL 為糖尿病腎病建模成功標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 分組與給藥 將造模小鼠隨機(jī)分為模型組、替米沙坦組、糖腎灌腸方+替米沙坦組,正常組、模型組灌胃給予生理鹽水,替米沙坦組按0.05 mL/10 g 劑量灌胃給藥,糖腎灌腸方+替米沙坦組按0.07 mL/10 g+0.05 mL/10 g 劑量灌胃給藥,每天1 次,連續(xù)4 周。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 一般狀態(tài) 觀察給藥后小鼠體質(zhì)量、行為學(xué)變化情況。

2.3.2 腎功能指標(biāo) 分別收集小鼠尿液和血液,Hitachi7170A 型自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐水平,考馬斯亮藍(lán)顯色法檢測(cè)尿微量白蛋白表達(dá)。

2.3.3 腎臟病理形態(tài)學(xué) 小鼠腎皮質(zhì)用10%中性福爾馬林固定,乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,制成3 μm 切片,HE 染色后在光鏡下觀察。冷刀片切取0.5 mm3小鼠腎組織,置于4%戊二醛固定液中,4 ℃下固定2 h,PBS 清洗3 次,1%四氧化鋨固定2 h,乙醇、丙酮梯度脫水,環(huán)氧樹(shù)脂浸透、包埋、聚合、切片,醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色,在透射電鏡(TEM) 下觀察。

2.3.4 免疫組織化學(xué) 小鼠腎皮質(zhì)固定,脫水,石蠟包埋,脫蠟,按免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行TLR5 (1∶500) 染色,在光鏡下觀察其分布。

2.3.5 TLR5 蛋白表達(dá) 采用Western blot 法。提取小鼠腸道組織總蛋白,液氮研磨,半干法電泳轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗(抗TLR5 兔多抗,1∶500稀釋)、二抗(鼠抗兔-HRP 抗體,1∶500 稀釋),ECL 發(fā)光、顯影,抗β-actin 抗體(1∶500 稀釋) 作為內(nèi)參,以其與β-actin 比值為T(mén)LR5 蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),若符合正態(tài)分布,則組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn),數(shù)據(jù)以() 表示；若不符合正態(tài)分布,則組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。 P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況 在造模過(guò)程中,正常組小鼠毛色光亮,無(wú)脫毛,活動(dòng)自如；模型組小鼠明顯瘦小,毛較粗糙,色澤黯淡,食物、水消耗較正常組多,喜靜少動(dòng)。各組小鼠體質(zhì)量見(jiàn)表1,可知正常組更高(P＜0.05),而其他各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。另外,給藥后模型組、替米沙坦組、糖腎灌腸方+替米沙坦組小鼠分別死亡7、8、6 只,最終納入37 只進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 糖腎灌腸方對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（）

表1 糖腎灌腸方對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（）

注:與模型組比較,△P＜0.05。

3.2 血肌酐水平、尿微量白蛋白表達(dá) 與正常組比較,模型組血肌酐水平、尿微量白蛋白表達(dá)升高(P＜0.01)；與模型組比較,替米沙坦組、糖腎灌腸方+替米沙坦組兩者降低(P＜0.01),其中糖腎灌腸方+替米沙坦組降低程度更明顯,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見(jiàn)表2。

表2 糖腎灌腸方對(duì)血肌酐水平、尿微量白蛋白表達(dá)的影響（）

表2 糖腎灌腸方對(duì)血肌酐水平、尿微量白蛋白表達(dá)的影響（）

注:與正常組比較,**P＜0.01；與模型組比較,△△P＜0.01。

3.3 HE 染色 圖1 顯示,正常組小鼠腎小球毛細(xì)血管袢開(kāi)放良好,腎小球毛細(xì)血管壁薄而纖細(xì),血管袢外被足細(xì)胞,腎小囊壁完整、纖細(xì)；模型組小鼠腎小球體積增大,腎小球細(xì)胞增多,毛細(xì)血管袢開(kāi)放尚可,管壁僵硬,足細(xì)胞減少,腎小囊壁完整；替米沙坦組小鼠腎小球體積稍大,腎小球細(xì)胞增多,毛細(xì)血管袢開(kāi)放尚可,管壁僵硬,足細(xì)胞減少,腎小囊壁完整；糖腎灌腸方+替米沙坦組小鼠腎小球體積稍大,腎小球細(xì)胞增多,毛細(xì)血管袢開(kāi)放尚可,管壁僵硬,足細(xì)胞減少,腎小囊壁完整。

圖1 各組小鼠HE 染色（×400）

3.4 TEM 觀察 圖2 顯示,正常組小鼠內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)腫脹,系膜細(xì)胞未見(jiàn)明顯增生,周?chē)的せ|(zhì)無(wú)擴(kuò)大,足突細(xì)胞未見(jiàn)異常,僅見(jiàn)少量足突融合。基底膜較厚；模型組小鼠系膜細(xì)胞核畸形,系膜細(xì)胞增生,足細(xì)胞核外形不規(guī)則,血管腔閉塞,系膜基質(zhì)不規(guī)則,系膜內(nèi)可見(jiàn)中等電子密度沉積物,基底膜增厚、皺縮,毛細(xì)血管皺縮；替米沙坦組小鼠系膜細(xì)胞明顯增生,系膜基質(zhì)輕度增生,系膜區(qū)可見(jiàn)纖維增生,內(nèi)皮細(xì)胞輕度腫脹,呈連拱狀改變,部分空泡樣改變,足突可見(jiàn)階段性融合,腎小球基底膜彌漫性增厚；糖腎灌腸方+替米沙坦組小鼠基底膜輕微皺縮,毛細(xì)血管袢塌陷,足突細(xì)胞階段性融合,腎小球基底膜階段性增厚。

圖2 各組小鼠TEM 圖（×8 000）

3.5 免疫組織化學(xué) 圖3 顯示,正常組小鼠TLR5 主要分布在腎小球及腎小管中,無(wú)明顯表達(dá)；模型組小鼠TLR 主要表達(dá)在近端小管的細(xì)胞質(zhì)內(nèi),呈黃色顆粒,在腎小體、遠(yuǎn)端小管內(nèi)均無(wú)陽(yáng)性表達(dá)；替米沙坦組小鼠TLR5 主要表達(dá)在近端小管的細(xì)胞質(zhì)內(nèi),呈淺淡黃色顆粒,弱陽(yáng)性表達(dá),在腎小體和遠(yuǎn)端小管細(xì)胞無(wú)陽(yáng)性顆粒；糖腎灌腸方+替米沙坦組小鼠腎小球、腎小管細(xì)胞質(zhì)中均有少量淡黃色顆粒。

3.6 TLR5 蛋白表達(dá) 與正常組比較,模型組、糖腎灌腸方+替米沙坦組TLR5 蛋白表達(dá)升高(P＜0.01),替米沙坦組、糖腎灌腸方+替米沙坦組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與模型組比較,正常組、替米沙坦組、糖腎灌腸方+替米沙坦組TLR5 蛋白表達(dá)降低(P＜0.01),見(jiàn)表3、圖4。

圖3 各組小鼠免疫組織化學(xué)染色（×400）

表3 糖腎灌腸方對(duì)TLR5 蛋白表達(dá)的影響（，n=5）

表3 糖腎灌腸方對(duì)TLR5 蛋白表達(dá)的影響（，n=5）

注:為方便繪制Western blot 圖,每組均取5 只小鼠。與正常組比較,**P＜0.01；與模型組比較,△△P＜0.01。

4 討論

糖尿病腎病為糖尿病主要微血管并發(fā)癥之一,是慢性高血糖所致的腎臟損害,病變累及全腎,臨床上以持續(xù)白蛋白尿、腎小球?yàn)V過(guò)率進(jìn)行性下降、高血壓、水腫、貧血為主要特征,如不積極治療,則最終進(jìn)展為終末期腎病[9]。因此,如何延緩糖尿病腎病進(jìn)展成為目前治療的重中之重。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,替米沙坦后可降低糖尿病腎病小鼠尿微量白蛋白表達(dá),而且在此基礎(chǔ)上結(jié)合糖腎灌腸方灌腸治療后肌酐、尿微量白蛋白表達(dá)也有所下降,雖然差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但擴(kuò)大樣本量后可能會(huì)更明顯地觀察到此趨勢(shì),這與患者使用后明顯降低尿微量白蛋白的報(bào)道相符[10-11]。由此表明,糖腎灌腸方在改善糖尿病腎病進(jìn)展中發(fā)揮了一定作用,而且在光鏡、電鏡下發(fā)現(xiàn)治療后腎小球基底膜、足突細(xì)胞改善,也能印證這一事實(shí)。

大量研究表明,炎癥、免疫反應(yīng)在促進(jìn)糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,而Toll 樣受體(TLRs) 系統(tǒng)在激活炎性反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、啟動(dòng)和調(diào)節(jié)天然免疫、誘導(dǎo)獲得性免疫中扮演重要角色,其中TLR2、TLR4 均參與了炎癥反應(yīng)[12]。近年來(lái),Toll 樣受體-5 (TLR5) 的致炎作用也受到廣泛關(guān)注,它是機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別細(xì)菌鞭毛蛋白的受體,與鞭毛蛋白結(jié)合后介導(dǎo)機(jī)體針對(duì)病原菌的先天性免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng),在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均可發(fā)現(xiàn)腸腔上皮細(xì)胞能產(chǎn)生該因子[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn),替米沙坦干預(yù)后TLR-5蛋白表達(dá)明顯下降,聯(lián)用糖腎灌腸方后其表達(dá)稍上升,可能是其余蛋白表達(dá)所致,但在靶器官腎臟中其改善程度更明顯,故推測(cè)可能通過(guò)抑制其表達(dá)來(lái)使腸道炎性反應(yīng)及免疫反應(yīng)明顯改變。

圖4 各組小鼠TLR5 蛋白表達(dá)

糖腎灌腸方由生大黃(后下)、煅牡蠣、丹參、黑順片(先煎)、澤瀉、生槐花、黃芩等藥材組成,方中君藥大黃具有攻積導(dǎo)滯、瀉火解毒、涼血化瘀、泄?jié)崂虻裙πАＷ粢再|(zhì)重之牡礪,以斂陰潛陽(yáng)。收斂固澀,化痰軟堅(jiān)；與丹參、生槐花共同作用以充分吸附腸道毒素,可清除三焦壅塞濕濁之邪,蕩滌腸胃熱毒之穢,使氮質(zhì)代謝產(chǎn)物從腸道排出,而且其“瀉而不猛”；黑順片辛溫大熱,其性善走,為通行十二經(jīng)純陽(yáng)之要藥,外則達(dá)皮毛而除表寒,里則達(dá)下元而溫痛冷,制約大黃寒涼之性；澤瀉氣平,味甘而淡,最善滲泄水道,專(zhuān)能通行小便；黃芩性清肅以除邪,味苦以燥濕,故能清熱瀉火解毒。研究表明,大黃可顯著降低糖尿病腎病大鼠血漿中尿素、肌酐水平,改善腎臟病理組織學(xué)病變,對(duì)腎臟具有明顯的保護(hù)作用[15]；黃芩中黃芩苷能降低鏈脲酶素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的血糖水平[16],而黃芩素對(duì)腎病、視網(wǎng)膜病變等糖尿病并發(fā)癥都有一定治療作用[17]；煅牡蠣含有大量的碳酸鈣,在收斂吸附方面起到一定作用,不但可遏制大黃瀉下太過(guò),還能增加灌腸液的滲透壓,有利尿素、肌酐等毒性物質(zhì)的排出。

中藥保留灌腸是一種傳統(tǒng)的中藥透析法,結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的面積可達(dá)10 m2左右,較腹膜和體表面積大5 倍,加上結(jié)腸頻繁蠕動(dòng),使透析液與結(jié)腸黏膜充分接觸,加速腸腔與血液間的物質(zhì)交換,使部分藥液在結(jié)腸內(nèi)吸收,而部分直接發(fā)揮作用,促使毒素從腸道排出,降低血肌酐、尿素氮水平。尤其是糖尿病腎病腎功能不全的患者,因多年糖尿病導(dǎo)致其胃腸功能均有不同程度的損害,相關(guān)癥狀突出,加之腎功不全毒素蓄積體內(nèi),又進(jìn)一步刺激胃腸引發(fā)中毒癥狀,使得服藥困難。中醫(yī)認(rèn)為,肺與大腸相表里,藥物經(jīng)腸道吸收后可過(guò)經(jīng)脈上傳于肺,由其宣發(fā)肅降之性將藥物作用送至全身,從而發(fā)揮藥效。

綜上所述,糖腎灌腸方聯(lián)合替米沙坦對(duì)糖尿病腎病小鼠腎損傷具有保護(hù)作用,可能與下調(diào)TLR5 蛋白表達(dá)有關(guān)。但中藥具有多靶點(diǎn)的特點(diǎn),故對(duì)糖腎灌腸方具體參與機(jī)制仍需進(jìn)行深入研究。