王 璽,李 凱,馮康虎,高玉海,陳克明*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000;2.甘肅省中醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000;3.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院骨科研究所,甘肅 蘭州 730000)

廢用性骨質(zhì)疏松癥是由于骨骼承受的機(jī)械力減少,導(dǎo)致骨量局部或全身性減少而引起的一種繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。一般見于腦出血、心肌梗死等需要長期臥床的病人或脊髓損傷,骨折后肢體活動障礙的患者以及長期太空飛行的相關(guān)工作人員。資料顯示,人的機(jī)體在長期臥床或失重的狀態(tài)下骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率可達(dá)81%,而骨折的發(fā)生率則高達(dá)為39%[1]。這些患者通常還伴隨有腎結(jié)石、關(guān)節(jié)周圍的異位骨化、病理性骨折等多種并發(fā)癥[2],因此越來越受到人們的重視。

廢用性骨質(zhì)疏松癥的患者往往有疼痛、肢體乏力、失運(yùn)等癥狀及體征,屬于中醫(yī)的“骨痹” “骨痿” 病。中醫(yī)認(rèn)為本病是以腎虛、脾虛、肝虛為本,氣滯血瘀為標(biāo)的本虛表實之癥,因此具有補(bǔ)腎、健脾、活血等功效的中藥成為中醫(yī)藥防治廢用性骨質(zhì)疏松癥的首選藥物[3]。丹參是常見的活血化瘀藥物之一,具有“活血調(diào)經(jīng),祛瘀止痛,養(yǎng)血安神” 等功效[4],而丹參酮ⅡA作為丹參有效成分之一,它不僅具有溫和的雌激素樣活性[5],而且可以改善微循環(huán),舒張血管,抗炎及清除自由基等多種生物學(xué)效應(yīng)[6],所以近年來丹參酮ⅡA在防治骨質(zhì)疏松癥方面一直被寄予厚望。解放軍第九四〇醫(yī)院骨研所課題組經(jīng)過前期實驗研究發(fā)現(xiàn)了丹參酮ⅡA可以對抗去卵巢大鼠所致的骨質(zhì)疏松癥[7],提高生長期大鼠的峰值骨量[8],它是否可以用來防治廢用性骨質(zhì)疏松癥,值得我們關(guān)注。因此本課題通過尾部懸吊的方法,建立廢用性骨質(zhì)疏松大鼠模型,早期給予丹參酮ⅡA進(jìn)行灌胃干預(yù),通過檢測大鼠骨代謝的變化,初步探討丹參酮ⅡA對廢用性骨質(zhì)疏松的防治作用,為廢用性骨質(zhì)疏松癥的防治提供實驗依據(jù),也為今后的臨床應(yīng)用奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雌性2 月齡wistar 大鼠30 只,體質(zhì)量為(175.83±1.33) g,購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,許可證號:SCXK (甘) 2015-0005。

1.2 試劑及藥物 丹參酮ⅡA(陜西寶雞辰光生物科技有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,批號HT034210198)；鹽酸四環(huán)素(東京化成工業(yè)株式會社,日本)；鈣黃綠素(Sigma-Aldrich 公司,日本)；水合氯醛(天津大茂化學(xué)試劑公司,中國)；血清骨鈣素試劑盒(IDS 公司,英國)；抗酒石酸酸性磷酸酶5b 試劑盒(IDS 公司,英國)。

1.3 儀器 雙能X 線骨密度儀(Prodigy,美國GE 公司),正置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司),萬能材料試驗機(jī)(AG-IS,日本島津公司),硬組織切片機(jī)(SP1600,德國LEICA 公司) 等。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥 將2 月齡SPF 級雌性wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周,利用隨機(jī)區(qū)組法分為對照組、尾吊組、丹參酮ⅡA組,每組10 只。尾吊組和丹參酮ⅡA組大鼠建立尾吊模型:分別用75% 的酒精搽涂大鼠尾部表面,去除油脂和皮屑,自需尾吊大鼠一側(cè)尾根部起,按縱向走行,將適宜長度和寬度的醫(yī)用透氣膠帶粘貼于尾部表面距尾尖部3～5 cm 遠(yuǎn),接著在粘貼膠帶的部位,放置鋼絲環(huán),再一次輕輕加繞膠帶2～3 圈,固定鋼絲環(huán)。用尾吊籠子里的鐵環(huán)掛鉤將鋼絲環(huán)鎖定,通過調(diào)節(jié)鐵鏈的高低來維持大鼠頭部始終處于低位,使大鼠身體的縱軸與水平傾斜呈30°角,恰好可使大鼠的后爪在伸直位時不觸及籠子的底部,即使大白鼠后肢始終處于懸空不負(fù)重的狀態(tài),但前肢可著地自由活動,可正常覓食飲水。

2.2 操作方法 大鼠在中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院SPF 級動物實驗中心飼養(yǎng)。尾吊模型建立后,將丹參酮ⅡA在研缽內(nèi)研磨后配置成懸濁液,然后給丹參酮ⅡA組大鼠按11 mg/kg 給藥灌胃,對照組及尾吊組則給予等量的蒸餾水灌胃,灌胃后造模組大鼠均繼續(xù)維持后肢懸空狀態(tài)。各組大鼠于每天同一時間開始給藥灌胃,連續(xù)4 周,每天1 次,實驗期間密切觀察大鼠生理反應(yīng)和生活習(xí)性的變化,注意尾吊情況、皮毛色澤、鼠尾血循環(huán),每7 d 測量體質(zhì)量1 次。所有大鼠在第14、15 天皮下注射四環(huán)素,劑量為20 mg/kg；處死前第3、4 天皮下注射鈣黃綠素,劑量為10 mg/kg。各組大鼠均于4 周后處理,處理前均進(jìn)行體質(zhì)量測定,用10%水合氯醛腹腔麻醉,腹主動脈采血后處死,抽抗凝血約3 mL,室溫下靜置10 min 后,3 000 r/min離心5 min,用移液槍吸取血清,保存于-80 ℃冰箱內(nèi)待檢。取雙側(cè)股骨、脛骨,腰椎,用生理鹽水濕紗布包裹后放入密封袋中,存入-20 ℃冰箱保存,待測量前自然解凍。

2.3 指標(biāo)測定

2.3.1 實驗動物生活習(xí)性的觀察和體質(zhì)量的測定 實驗期間密切觀察大鼠生理、生活習(xí)性的變化,維持懸吊,注意皮毛色澤、鼠尾血循環(huán)的改變,防止懸吊脫落或斷尾情況。每周測量大鼠體質(zhì)量1 次。

2.3.2 骨密度測定 將右側(cè)脛骨、腰椎自然解凍后,置于雙能X 線骨密度儀下,分別檢測離體骨密度。

2.3.3 骨生物力學(xué)性能測定 應(yīng)用萬能材料試驗機(jī),分別進(jìn)行股骨三點彎曲試驗及椎體壓縮試驗。①三點彎曲試驗時,將凍存的右股骨自然解凍后置于AG-IS 生物力學(xué)萬能試驗機(jī)上,跨距14 mm,加載速度10 mm/min,計算機(jī)記錄載荷變形曲線及最大載荷、彈性模量；②壓縮試驗時,將椎骨自然解凍,分離第四腰椎椎體,用剪刀小心剪除椎間盤,并用砂紙打磨上下兩端至平行,將磨制好的椎體置于試驗機(jī)上,以2 mm/min 的加載速度進(jìn)行壓縮,測量最大載荷、彈性模量。

2.3.4 骨代謝生化指標(biāo)測定 檢測骨鈣素(OC)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRACP 5b),均采用英國IDS 公司生產(chǎn)的試劑盒。按說明制作各自標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣品中OC、TRACP 5b 水平,單位分別為ng/mL、U/L。

2.3.5 骨形態(tài)計量學(xué)測定 將凍存的椎體自然解凍后分離第5 腰椎,將其保存于70%酒精中,包埋前將第5 腰椎體進(jìn)行酒精脫水,二甲苯透明后采用不脫鈣塑料包埋法包埋。將包埋好的骨組織置于SP1600 硬組織切片機(jī)切片,厚度為30 μm,先后用1 000～2 000 的砂紙進(jìn)行打磨,先在顯微鏡下進(jìn)行雙熒光標(biāo)記觀察并拍照,再經(jīng)VG 染色,在顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。圖片采用IPP6.0 圖片分析軟件,進(jìn)行骨形態(tài)計量學(xué)分析。

2.3.6 椎體的HE 染色及成骨細(xì)胞計數(shù) 將凍存的椎體自然解凍后分離第3 腰椎,將其放于4% 多聚甲醛中固定24 h,然后在10% EDTA 溶液中脫鈣4 周,平行于椎板,將椎體切成兩半,并進(jìn)行石蠟包埋,獲得4 μm 厚的切片,將其固定在聚賴氨酸處理的抗脫落載玻片上,脫蠟,蘇木精-伊紅(HE) 染色,然后在光學(xué)顯微鏡下觀察。成骨細(xì)胞的密度通過IPP6.0 圖片分析軟件,對椎骨骨膜表面單位視野中的梭形成骨細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計。

2.3.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件處理,計量資料以() 表示,數(shù)據(jù)通過正態(tài)檢驗后,不同組間比較采用單因素方差分析,方差齊則組間兩兩比較采用LSD,若方差不齊則采用Games-Howell 法。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量變化結(jié)果 實驗期間各組大鼠飲食正常,體質(zhì)量均有所增長。尾吊一定程度上影響了大鼠的體質(zhì)量,但各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),說明尾吊模型及藥物處理對其生長無明顯影響(見圖1)。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量

3.2 離體骨密度檢測結(jié)果 尾吊組脛骨、椎體離體骨密度與對照組相比均減低(P＜0.01),說明尾吊的建立可以導(dǎo)致大鼠骨量的流失；丹參酮ⅡA組與尾吊組相比其骨密度有所升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),說明丹參酮ⅡA對尾吊大鼠骨密度有一定的提升作用,如表1 所示。

表1 各組大鼠脛骨和椎體離體骨密度比較（，n=10）

表1 各組大鼠脛骨和椎體離體骨密度比較（，n=10）

注:與尾吊組比較,◆P＜0.05。

3.3 股骨三點彎曲和椎體壓縮實驗結(jié)果 與對照組相比,尾吊組的股骨和椎體的最大載荷、彈性模量均下降(P＜0.01)；丹參酮ⅡA組的股骨和椎體的最大載荷值與尾吊組相比均有所升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；股骨及椎體的彈性模量與尾吊組相比也有所增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),說明尾吊后大鼠股骨及椎體的骨密度均有所下降,丹參酮ⅡA可以對抗骨量的丟失,如表2、3所示。

表2 各組大鼠股骨生物力學(xué)指標(biāo)比較（，n=10）

表2 各組大鼠股骨生物力學(xué)指標(biāo)比較（，n=10）

注:與尾吊組比較,◆P＜0.05。

表3 各組大鼠椎體生物力學(xué)指標(biāo)比較（，n=10）

表3 各組大鼠椎體生物力學(xué)指標(biāo)比較（，n=10）

注:與尾吊組比較,◆P＜0.05。

3.4 大鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果 與對照組相比,尾吊組的血清OC 指標(biāo)降低(P＜0.01),而丹參酮ⅡA組與尾吊組比,OC 值有所升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),說明丹參酮ⅡA可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌OC,從而促進(jìn)骨的形成；與對照組相比,尾吊組血清TRACP 5b 指標(biāo)有所增加,統(tǒng)計學(xué)有差異 (P ＜0.01),而丹參酮ⅡA組與尾吊組相比,TRACP 5b 指標(biāo)有所降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),說明丹參酮ⅡA一定程度上可以抑制破骨細(xì)胞分泌TRACP 5b,如圖2 所示。

圖2 血清生化指標(biāo)比較

3.5 骨形態(tài)計量學(xué)結(jié)果

3.5.1 椎體VG 染色結(jié)果 如圖3 所示,椎體骨組織呈紅色,椎體內(nèi)紅色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為骨小梁；尾吊組和丹參酮ⅡA組與對照組相比,其骨小梁結(jié)構(gòu)均比較稀疏,數(shù)量也較少,骨小梁的分離度略有增加。如圖4 所示,與對照組相比,尾吊組的骨小梁的數(shù)目、厚度均明顯減少,骨小梁分離程度明顯增加,差異均有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；丹參酮ⅡA組與尾吊組相比,骨小梁數(shù)量及厚度均有所增加(P＜0.01,P＜0.05),分離度也有所改善(P＜0.05)。

圖3 椎體VG 染色比較（×40）

圖4 椎體骨小梁微結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較

3.5.2 椎體熒光標(biāo)記結(jié)果 如圖5 所示,與對照組相比,尾吊組及丹參酮ⅡA組的雙熒光標(biāo)記間的距離均較小。如圖6 所示,與對照組相比,尾吊組的雙熒光間距減小,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；丹參酮ⅡA組與尾吊組相比,雙熒光間距有所增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),說明丹參酮ⅡA在一定程度上促進(jìn)了椎體骨量的增殖。

圖5 椎體雙熒光標(biāo)記比較（×100）

圖6 椎體雙熒光標(biāo)記間距量化值比較

3.6 大鼠椎體HE 染色結(jié)果 如圖7 所示,椎體骨組織呈粉紅色,椎體骨組織骨膜附近黑色梭形細(xì)胞為成骨細(xì)胞；與對照組相比,尾吊組成骨細(xì)胞均比較稀疏,數(shù)量較少,細(xì)胞質(zhì)也不飽滿。如圖8 所示,與對照組相比,尾吊組成骨細(xì)胞數(shù)目明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；丹參酮ⅡA組與尾吊組相比,其成骨細(xì)胞的數(shù)目有所增加(P＜0.01),說明丹參酮ⅡA在一定程度上可以保護(hù)成骨細(xì)胞,減輕其凋亡。

圖7 椎體HE 染色比較（×40）

圖8 椎體成骨細(xì)胞計數(shù)比較

4 討論

中醫(yī)藥治療各種疾病有數(shù)千年的歷史,因為其療效可靠,副作用小,廣泛被人們所接受。中醫(yī)認(rèn)為“痹有瘀血”,因此血瘀是廢用性骨質(zhì)疏松癥的病因之一?！饵S帝內(nèi)經(jīng)·素問·宣明五氣篇》曰“久臥傷氣”,而“氣為血之帥”,氣行則血行,氣止則血止,氣滯血瘀則骨髓失養(yǎng),發(fā)為“骨痿”。尾吊模型的建立模擬了患者“久臥” 的病理狀態(tài)。丹參是祖國醫(yī)學(xué)中經(jīng)典的活血化瘀藥物之一,具有活血補(bǔ)血的功效,丹參酮ⅡA又是其主要的活性成分之一。丹參酮ⅡA可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,增加堿性磷酸酶、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、Runx2 等的表達(dá)[9-10],通過抑制 NF-κB、PI3-kinase/Akt 和 MAPK 途 徑,減 弱RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成[11],通過抑制破骨細(xì)胞分泌前列腺素E2來抑制骨的吸收[12]。因此,本實驗以丹參酮ⅡA為實驗藥物,參考前期課題組的灌胃劑量11 mg/kg[8],來研究它對尾吊大鼠發(fā)生廢用性骨質(zhì)疏松癥的防治作用。

尾吊模型是通過大鼠肢體的廢用和失重而建立的一種廢用性骨質(zhì)疏松模型,因為其造模方式引起的全身應(yīng)激反應(yīng)最小[13],即使尾吊期間應(yīng)用1,25-二羥基維生素D、生長素、膳食鈣、阿倫磷酸鹽和肌肉刺激等,也不能完全糾正骨骼由于卸載而導(dǎo)致的生長抑制,因此尾吊大鼠模型可用于研究卸載對骨骼的生理作用及細(xì)胞機(jī)制,也是目前國際公認(rèn)的失重條件下對骨代謝進(jìn)行研究的較為適宜動物模型[14]。本次實驗結(jié)果顯示,尾吊導(dǎo)致大鼠下肢及椎體骨量的流失,離體骨密度及骨生物力學(xué)均出現(xiàn)明顯下降；血清中的骨代謝指標(biāo)提示,尾吊大鼠的骨形成減弱,骨吸收增強(qiáng)；通過對椎體骨組織形態(tài)的測量,分別從靜態(tài)和動態(tài)的組織學(xué)參數(shù)中進(jìn)一步了解到尾吊大鼠椎體骨結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯退變；椎體HE 染色也可見骨組織中成骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少。

骨密度的測量對骨質(zhì)疏松癥的診斷、治療及隨訪均有重要的意義。本研究通過對大鼠右側(cè)脛骨及椎體的離體骨密度進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn),丹參酮ⅡA組大鼠的骨密度有了一定的改善,明確了丹參酮ⅡA對卸載導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松有一定防治作用。

骨生物力學(xué)是通過機(jī)械試驗的方法來測量骨骼的強(qiáng)度和剛度,可以了解骨骼的力學(xué)性能及骨密度狀況[15]。實驗中股骨三點彎曲試驗及椎體壓縮試驗結(jié)果都表明了丹參酮ⅡA組大鼠股骨及椎體的最大載荷、彈性模量均有明顯提高。說明丹參酮ⅡA可以改善骨骼的強(qiáng)度和韌性,減少骨折的發(fā)生。

OC 是公認(rèn)的反映骨形成敏感而特異的指標(biāo),往往可以提示新生成骨細(xì)胞的活性,與骨組織形成的指標(biāo)成正比,而TRACP 5b 則是由破骨細(xì)胞發(fā)生骨吸收時釋放的,因此它可以同時反映了破骨細(xì)胞的活性及骨吸收的狀況。通過對大鼠血清結(jié)果的分析,我們發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA促進(jìn)了新生成骨細(xì)胞的活性,增加了OC 的分泌,加快了骨組織的生長增殖。同時我們也看到丹參酮ⅡA在一定程度上抑制了破骨細(xì)胞的活性,從而減少了TRACP 5b 的分泌,阻止骨的吸收。由此可見丹丹參酮ⅡA是通過雙向調(diào)節(jié)來維持尾吊大鼠骨量,對抗骨量丟失的。

骨組織的VG 染色及雙熒光標(biāo)記,可以使我們分別從靜態(tài)和動態(tài)的組織學(xué)參數(shù)中進(jìn)一步了解骨微觀結(jié)構(gòu)的變化[16]。實驗中丹參酮ⅡA組的骨小梁的數(shù)目、厚度明顯增加,骨小梁也較密集；丹參酮ⅡA組的雙熒光間距也高于尾吊組。這些說明丹參酮ⅡA不僅在一定程度上抑制了骨量吸收,還可促進(jìn)骨組織的增殖。

骨組織切片的HE 染色可以清楚觀察到骨組織中成骨細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài),是一種經(jīng)典的染色方法。實驗中我們觀察到丹參酮ⅡA減輕了椎體骨組織中成骨細(xì)胞的凋亡,使成骨細(xì)胞的數(shù)量增多,細(xì)胞形態(tài)更加飽滿。

綜上所述,丹參酮ⅡA改善了尾吊模型建立的廢用性骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度和骨質(zhì)量,這表明它對廢用性骨質(zhì)疏松有一定的防治作用,但是由于其脂溶性高、生物利用度低和半衰期短等缺點[17],也給臨床的應(yīng)用帶來了一定的困難,因此需要我們進(jìn)一步深入研究它對骨代謝影響的作用機(jī)制,對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)?shù)母脑煨揎?改善它的理化性質(zhì)及藥動學(xué)特點,進(jìn)一步挖掘它對廢用性骨質(zhì)疏松癥的防治潛能。