陳 雨 林高城白 亮

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院神經(jīng)康復(fù)二科,福建 福州 350003;2.福建省康復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350031)

中風(fēng)是由腦血管破裂或血管阻塞引起的一種腦損傷,每年在世界上內(nèi)可造成4 400 萬人殘疾[1]。其中,缺血性中風(fēng)會導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)功能缺損[2],目前有效減少梗塞面積的溶栓術(shù)是其主要治療方法[3],但在恢復(fù)血液灌注后,缺血性腦組織中經(jīng)常會發(fā)生不可逆的腦缺血再灌注損傷,嚴(yán)重限制了缺血性中風(fēng)患者的康復(fù)。

蘇合香是金縷梅科植物蘇合香樹Liquidimibar orientalis Mill.的樹干滲出的香樹脂經(jīng)加工精制而成的中藥,具有開竅、辟穢、止痛的功效,用于治療中風(fēng)痰厥、猝然昏倒、胸痹心痛、胸腹冷痛、驚癇[4],揮發(fā)油是其重要藥效成分之一,對頸動脈結(jié)扎的不完全性腦缺血再灌注損傷大鼠具有一定保護(hù)作用,夠減輕氧化應(yīng)激損傷和抑制腦細(xì)胞凋亡[5],但該藥材在糖氧剝奪/再復(fù)氧誘導(dǎo)的腦缺血再灌注損傷中的作用及其機(jī)制尚不清楚。Toll 樣受體9 (TLR9)是TLR 家族成員之一,已被證實(shí)在腦梗死大鼠中的表達(dá)明顯上調(diào),參與腦梗死后的組織修復(fù)和炎癥損傷過程[6]。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞為對象,利用糖氧剝奪/再復(fù)氧建立腦缺血再灌注損傷模型,以研究蘇合香揮發(fā)油對其神經(jīng)細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激的影響,通過TLR9探索其潛在分子機(jī)制,為相關(guān)治療劑提供參考。

1 材料

SD 大鼠[出生1～2 d,動物生產(chǎn)許可證號SCXK (滬)2014-0003]購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司。蘇合香購自亳州清逸中藥材有限公司。神經(jīng)元培養(yǎng)基(Neurobasal-A medium) 購自美國Gibco 公司；兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 (caspase-3)、兔抗TLR9、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH) 一抗購自英國Abcam 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗購自武漢博士德生物公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA) 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 蘇合香揮發(fā)油制備 參照文獻(xiàn)[7]報道,水蒸氣蒸餾法提取50 g 藥材的揮發(fā)油,無水硫酸鈉干燥后,得到淺黃色透明油狀物(收油率為0.25%)。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照王凱華[8]報道的方法進(jìn)行。細(xì)胞貼壁后在神經(jīng)元培養(yǎng)基中培養(yǎng),生長環(huán)境為37 ℃、5% CO2,將培養(yǎng)6～7 d 的神經(jīng)細(xì)胞分為正常對照組、模型組(神經(jīng)細(xì)胞通過OGD/R 模擬腦缺血再灌注損傷) 及10、20、40 μg/mL 蘇合香揮發(fā)油組(揮發(fā)油和腦缺血再灌注處理神經(jīng)細(xì)胞)[9]。其中,腦缺血再灌注損傷根據(jù)周轉(zhuǎn)利[10]的報道,采用物理缺氧方法,以無糖神經(jīng)元培養(yǎng)基代替原有培養(yǎng)基,將細(xì)胞于含1%O2、94%N2、5%CO2的三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行OGD 處理1 h,之后更換為正常神經(jīng)元培養(yǎng)液再復(fù)氧24 h。蘇合香揮發(fā)油作用時間為24 h。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與處理 si-TLR9、si-TLR9 的陰性對照si-NC、pcDNA3.1-TLR9,以及pcDNA3.1-TLR9 的陰性對照pcDNA3.1 均由上海GenePharma 公司合成。將神經(jīng)細(xì)胞(2×104個) 接種于6 孔板,當(dāng)其融合至70% 時根據(jù)Lipofectamine 2000 試劑說明書指示,通過si-TLR9、pcDNA3.1-TLR9 進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分為si-NC 組、si-TLR9 組、40 μg/mL 蘇合香揮發(fā)油+pcDNA3.1 組、40 μg/mL 蘇合香揮發(fā)油+pcDNA3.1-TLR9 組,均進(jìn)行腦缺血再灌注處理。轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞,評價其腦缺血再灌注損傷的影響。

2.4 細(xì)胞存活檢測 采用CCK-8 法。將神經(jīng)細(xì)胞(5×104/孔) 接種到96 孔板上,經(jīng)“2.3” 項(xiàng)下方法處理后加入20 μL CCK-8 溶液,于37 ℃、5% CO2環(huán)境中孵育,1 h后通過酶標(biāo)儀在450 nm 波長處讀取每孔吸光度。

2.5 細(xì)胞凋亡檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集神經(jīng)細(xì)胞(1×106個),195 μL 含F(xiàn)ITC-annexin V 的結(jié)合緩沖液重懸,加入5 μL Annexin V-FITC,混勻,10 μL PI 染色液混勻,于黑暗、室溫下孵育,30 min 后置于流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡。

2.6 caspase-3、TLR9 蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。RIPA 裂解緩沖液裂解各組神經(jīng)細(xì)胞后,等量(20 μg)蛋白加到上樣緩沖液中后沸水變性10 min,在8%～12%十二烷基硫酸鈉(SDS) -聚丙烯酰胺凝膠(PAGE) 電泳凝膠上分離,電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜,5%脫脂牛奶封閉印跡并過夜,將聚偏二氟乙烯膜與一抗孵育2 h,與二抗孵育1 h,其中caspase-3、TLR9 蛋白一抗以1∶1 000 比例稀釋,對照GAPDH 以1∶2 000 比例稀釋,二抗以1∶5 000 比例稀釋。孵育結(jié)束后,通過增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液對結(jié)合抗體進(jìn)行可視化,Quantity One 軟件分析caspase-3、TLR9 蛋白條帶。

2.7 SOD 活性、MDA 水平檢測 采用試劑盒法。收集各組神經(jīng)細(xì)胞,按照檢測試劑盒說明書操作檢測SOD 活性、MDA 水平。

2.8 TLR9 mRNA 表達(dá)檢測 采用qPCR 法。收集各組神經(jīng)細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液洗滌后加入TRIzol 試劑分離細(xì)胞總RNA,cDNA 的合成通過Prime Script RT 試劑盒進(jìn)行,再根據(jù)制造商說明,通過SYBR Green Master Mix 試劑盒在ABI 7500 PCR 儀進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。TLR9 引物序列為正向5′-CCAGTTTGTCAGAGGGAGCC-3′,反向 5′-GGACAGGTGGACGAAGTCAG-3′；內(nèi)參GAPDH 引物序列為正向5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,反 向 5′-CACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3′,通過2-ΔΔCt法計(jì)算TLR9 mRNA 表達(dá)。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以() 表示,組間比較采用單因素方差分析、t 檢驗(yàn)、SNK-q 檢驗(yàn),P＜0.05 表示差異具有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 蘇合香揮發(fā)油對腦缺血再灌注損傷的影響 圖1、表1 顯示,與正常對照組比較,模型組神經(jīng)細(xì)胞存活率降低(P＜0.05),凋亡率、caspase-3 蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)；與模型組比較,各劑量蘇合香揮發(fā)油組神經(jīng)細(xì)胞存活率升高(P ＜0.05),凋亡率、caspase-3 蛋白表達(dá)降低 (P ＜0.05),并呈濃度依賴性。

圖1 蘇合香揮發(fā)油對腦缺血再灌注損傷模型凋亡（A） 及caspase-3 蛋白表達(dá)（B） 的影響

表1 蘇合香揮發(fā)油對腦缺血再灌注損傷的影響（，n=9）

表1 蘇合香揮發(fā)油對腦缺血再灌注損傷的影響（，n=9）

注:與正常對照組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05。

3.2 蘇合香揮發(fā)油對SOD 活性、MDA 水平的影響 表2顯示,與正常對照組比較,模型組SOD 活性降低(P ＜0.05),MDA 水平升高(P＜0.05)；與模型組比較,各劑量蘇合香揮發(fā)油組SOD 活性升高(P＜0.05),MDA 水平降低(P＜0.05),并呈濃度依賴性。

3.3 蘇合香揮發(fā)油對TLR9 表達(dá)的影響 圖2、表3 顯示,與正常對照組比較,模型組TLR9 mRNA 及蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)；與模型組比較,各劑量蘇合香揮發(fā)油組TLR9mRNA 及TLR9 蛋白表達(dá)降低 (P ＜0.05),并呈濃度依賴性。

表2 蘇合香揮發(fā)油對SOD 活性、MDA 水平的影響（，n=9）

表2 蘇合香揮發(fā)油對SOD 活性、MDA 水平的影響（，n=9）

注:與正常對照組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05。

圖2 各組TLR9 蛋白表達(dá)

表3 蘇合香揮發(fā)油對TLR9 表達(dá)的影響（，n=9）

表3 蘇合香揮發(fā)油對TLR9 表達(dá)的影響（，n=9）

注:與正常對照組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05。

3.4 抑制TLR9 對腦缺血再灌注損傷及SOD 活性、MDA 水平的影響 圖3、表4 顯示,與si-NC 組比較,si-TLR9 組TLR9 和caspase-3 蛋白表達(dá)、凋亡率、MDA 水平降低(P＜0.05),存活率、SOD 活性升高(P＜0.05)。

3.5 過表達(dá)TLR9 對腦缺血再灌注損傷的影響 圖4、表5顯示,與40 μg/mL 蘇合香揮發(fā)油+pcDNA3.1 組比較,40 μg/mL 蘇合香 揮發(fā)油+pcDNA3.1-TLR9 組 TLR9 和caspase-3 蛋白表達(dá)、凋亡率升高(P＜0.05),細(xì)胞存活率降低(P＜0.05)。

3.6 過表達(dá)TLR9 對SOD 活性、MDA 水平的影響 表6 顯示,與40 μg/mL 蘇合香揮發(fā)油+pcDNA3.1 組比較,40 μg/mL 蘇合香揮發(fā)油+pcDNA3.1-TLR9 組SOD 活性降低(P＜0.05),MDA 水平升高(P＜0.05)。

圖3 抑制TLR9 對TLR9 （A）、caspase-3 （B） 蛋白表達(dá)的影響

表4 抑制TLR9 對腦缺血再灌注損傷及SOD 活性、MDA 水平的影響（，n=9）

表4 抑制TLR9 對腦缺血再灌注損傷及SOD 活性、MDA 水平的影響（，n=9）

注:與si-NC 組比較,*P＜0.05。

圖4 過表達(dá)TLR9 對TLR9 （A）、caspase-3 （B） 蛋白表達(dá)的影響

4 討論

目前,對缺血性中風(fēng)的治療方法主要包括手術(shù)和藥物,其中神經(jīng)保護(hù)劑是特異性治療的主要方法[11],但腦缺血再灌注損傷機(jī)制復(fù)雜,涉及多種信號途徑和生物學(xué)過程[12]。本實(shí)驗(yàn)探討了蘇合香揮發(fā)油在改善腦缺血再灌注損傷中的生物學(xué)功能,并初步研究了其潛在的分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)該成分可通過減輕氧化應(yīng)激損傷來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,可能通過下調(diào)TLR9 表達(dá)來有效抑制氧化應(yīng)激,表明蘇合香有望成為相關(guān)新型天然藥物。

表5 過表達(dá)TLR9 對腦缺血再灌注損傷的影響（，n=9）

表5 過表達(dá)TLR9 對腦缺血再灌注損傷的影響（，n=9）

注:與40 μg/mL 蘇合香揮發(fā)油+pcDNA3.1 組比較,*P＜0.05。

表6 過表達(dá)TLR9 對SOD 活性、MDA 水平的影響（，n=9）

注:與40 μg/mL 蘇合香揮發(fā)油+pcDNA3.1 組比較,*P＜0.05。

蘇合香具有多種生物活性,如醒腦開竅、抗心肌缺血抗血栓、抗血小板凝聚等[13],其揮發(fā)油含安息香酸、苯甲醇、α-松油醇等成分[7]。前期報道,在頸動脈結(jié)扎誘導(dǎo)的腦缺血再灌注損傷大鼠中,蘇合香揮發(fā)油可引起腦組織較低的MDA 水平、細(xì)胞凋亡率,以及較高的SOD 活性,通過減輕氧化應(yīng)激損傷來起到保護(hù)效果[14]；提高二亞硫酸鈉導(dǎo)致PC12 細(xì)胞活性,保護(hù)缺血缺氧PC12 細(xì)胞損傷[9]；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該成分可明顯提高腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)細(xì)胞存活率,顯著降低凋亡率、caspase-3 蛋白表達(dá),并呈現(xiàn)濃度依賴性。

腦組織易受自由基破壞,氧化應(yīng)激在腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用[15]。研究表明,缺氧/氧自由基會介導(dǎo)過度的ROS 生成和氧化應(yīng)激,導(dǎo)致神經(jīng)和膠質(zhì)細(xì)胞死亡[16-17],神經(jīng)組織由于耗氧量、多不飽和脂肪酸含有量高,抗氧化能力相對較低,導(dǎo)致容易受到氧化攻擊[17],而蘇合香揮發(fā)油可通過抑制氧化應(yīng)激來發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。在蘇合香揮發(fā)油處理后的腦缺血再灌注損傷模型中,抗氧化酶SOD 活性明顯升高,脂質(zhì)過氧化中產(chǎn)物MDA 水平顯著減少,并呈濃度依賴性,表現(xiàn)了較強(qiáng)的抗氧化能力,與前期報道[14]相符。另外,在發(fā)生腦缺血再灌注損傷時,蘇合香揮發(fā)油減輕氧化應(yīng)激是神經(jīng)細(xì)胞促增殖和抗凋亡的原因,有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。

不同質(zhì)量濃度蘇合香揮發(fā)油可顯著降低腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞中TLR9 mRNA、TLR9 蛋白表達(dá),并呈濃度依賴性,可能與調(diào)控TLR9 表達(dá)有關(guān)。TLR9 在腦梗死早期大鼠的炎癥過程中發(fā)揮了重要作用[18]；在缺血性急性腎損傷中它促進(jìn)細(xì)胞損傷和凋亡,加劇缺血性急性腎損傷[19]；在非酒精性脂肪性肝炎中其表達(dá)上調(diào),缺失時對肝細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用[20]；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),抑制TLR9 時可明顯增加腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)細(xì)胞存活率和SOD 活性,顯著減少凋亡率、caspase-3 蛋白表達(dá)、MDA 水平,表明抑制TLR9 可通過提高腦缺血再灌注損傷細(xì)胞增殖,減輕氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡來產(chǎn)生保護(hù)效果。另外,過表達(dá)TLR9 能減弱蘇合香揮發(fā)油對腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞存活、SOD 活性的促進(jìn)作用,以及對細(xì)胞凋亡率、caspase-3 蛋白表達(dá)、MDA 水平的抑制作用,表明該成分可能是通過抑制TLR9 表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

綜上所述,蘇合香揮發(fā)油可促進(jìn)腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,減輕氧化應(yīng)激,表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)活性,其作用機(jī)制可能與下調(diào)TLR9 表達(dá)有關(guān),可為該藥材在相關(guān)治療方面的潛力提供了新證據(jù)。