李亞玲 董娟娟李俊杰劉永琦 展文華舍雅莉*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730000;2.敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730000)

胃癌是發(fā)病率、死亡率分別位居第5、3 位的惡性腫瘤,目前臨床治療以手術(shù)結(jié)合化療為主,但效果有限,晚期患者采用一線化療方案的無(wú)進(jìn)展生存率不到1 年,平均總生存時(shí)間不到2 年[1-2]。大量研究顯示,中醫(yī)藥在抗腫瘤聯(lián)合治療中起到了減毒增效的良好療效[3-4]。敦煌醫(yī)學(xué)具有重要的史料和臨床價(jià)值,敦煌平胃丸出自敦煌古書(shū)《不知名氏辨脈法》,甘肅省名中醫(yī)王道坤教授將此方進(jìn)行加減研發(fā)的萎胃靈膠囊在治療慢性萎縮性胃炎、防癌變方面取得顯著臨床效果[5-6],故本實(shí)驗(yàn)觀察該制劑對(duì)人胃癌SCG-7901 裸鼠移植瘤的抑制作用,并初步探討其機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞和動(dòng)物 人胃癌細(xì)胞株SCG-7901 (北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)。BALB/c 裸鼠60 只,SPF 級(jí),雌雄各半,周齡4 周左右,平均體質(zhì)量18～20 g,購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK (甘) 2015-0002)。本研究經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(編號(hào)2019-200)。

1.2 藥物 敦煌平胃丸免煎顆粒(甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,批號(hào)8112053) 由大黃15 g、苦參15 g、干姜15 g、藁本15 g、附子12 g、防風(fēng)15 g、桔梗15 g、土鱉蟲(chóng)15 g、人參15 g、玄參15 g、當(dāng)歸15 g 組成。順鉑(合肥巴斯夫生物科技有限公司,批號(hào)BSF190225,50 mg/支),以0.9%生理鹽水配制備用。

1.3 試劑與儀器 RPMI-1640 培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco 公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD 公司)；細(xì)胞懸液制備試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,批號(hào)2019425)；caspase 9、Bcl-2、caspase 3 抗體 (美國(guó)GeneTex 公司)。IX-81 型熒光倒置相差顯微鏡(日本Olympus 公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立 SCG-7901 在含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng),將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的該細(xì)胞重懸,并調(diào)整濃度為1×107/mL,于52 只裸鼠腋下接種0.2 mL 懸浮液,剩余8 只在相同條件下飼養(yǎng),但不進(jìn)行任何干預(yù)。1 周后,選取瘤體直徑大于5 mm、形態(tài)較均一的32 只裸鼠作為荷瘤成功,進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 敦煌平胃丸的制備 將敦煌平胃丸免煎顆粒溶于75 mL煮沸的蒸餾水中,相當(dāng)于生藥量0.7 g/mL,-20 ℃下貯存。

2.3 分組與給藥 以未荷瘤的8 只裸鼠為對(duì)照組(管飼法喂以10 mL/kg 0.9%NaCl 溶液)。根據(jù)給藥方式,將32只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為模型組(管飼法喂以10 mL/kg 0.9%NaCl 溶液)、平胃丸組(管飼法喂以140 mg/kg 平胃丸)、順鉑組(腹腔注射20 mg/kg 順鉑)、平胃丸+順鉑組(管飼法喂以140 mg/kg 平胃丸+腹腔注射20 mg/kg 順鉑),于荷瘤成功后24 h 內(nèi)給藥,每天1 次,連續(xù)10 d。

2.4 臟器指數(shù)、抑瘤率計(jì)算 裸鼠給藥后,每隔1 d 測(cè)量腫瘤短徑、長(zhǎng)徑各1 次,根據(jù)Steel 公式[(長(zhǎng)徑×短徑2)/2]計(jì)算其體積。停止給藥后24 h,脫頸處死裸鼠并解剖,觀察腫瘤生長(zhǎng)狀況、周?chē)K器受累情況,小心并快速剝離腫瘤組織及主要臟器,濾紙吸干組織液后稱(chēng)定質(zhì)量,置于-80 ℃冰箱中保存,或用4%多聚甲醛溶液固定48 h。抑制率=(1-V實(shí)驗(yàn)組/V對(duì)照組) ×100%,臟器指數(shù)=臟器平均質(zhì)量/裸鼠平均體質(zhì)量。

2.5 病理組織學(xué)觀察及免疫組化分析 將所需組織用4%多聚甲醛固定48 h 后,常規(guī)石蠟包埋切片,HE 染色,光學(xué)顯微鏡下觀察其病理情況。將低聚甲醛固定的腫瘤組織切片(厚4 μm) 固定在載玻片上,進(jìn)行免疫組化染色,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作加入按比例稀釋的一抗caspase 9(1∶200)、Bcl-2 (1∶100)、Bax (1∶200),以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照,二抗用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記,DAB 顯色。通過(guò)Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定,每張切片在400 倍下隨機(jī)選取5 個(gè)視野,對(duì)視野內(nèi)棕黃色陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行圖像分析,測(cè)定平均積分吸光度值(OD)。

2.6 腫瘤組織中細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) 采用TUNEL 法。將上述石蠟包埋的腫瘤組織以4 μm 厚度切片,按照TUNEL檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)組織中細(xì)胞凋亡情況。每張切片在高倍鏡(×400) 下隨機(jī)選取5 個(gè)視野,計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及凋亡細(xì)胞數(shù)量,計(jì)算凋亡率,公式為凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)) ×100%。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 21.0、Graph Pad Prism 8.0軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料以() 表示,多組間比較用單因素方差分析。 P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 裸鼠一般情況、體質(zhì)量 荷瘤成功后,各組裸鼠飲食、行為、精神狀態(tài)等均正常,用藥初期亦然。與對(duì)照組比較,模型組裸鼠一般情況基本正常；給藥后期,順鉑組裸鼠飲食和行動(dòng)減少,精神狀態(tài)和毛發(fā)光澤較差,出現(xiàn)抱團(tuán)現(xiàn)象,體質(zhì)量降低(P＜0.01)；平胃丸組裸鼠一般情況基本正常；平胃丸+順鉑組裸鼠飲食、行動(dòng)略有減少,體質(zhì)量下降,但與順鉑組比較有所改善(P＜0.01)。各組裸鼠體質(zhì)量見(jiàn)圖1。

3.2 裸鼠移植瘤體積 與對(duì)照組比較,平胃丸組、順鉑組、平胃丸+順鉑組裸鼠移植瘤體積減小(P＜0.01),抑瘤率分別為45.1%、67.2%、70.0%。見(jiàn)圖2。

3.3 裸鼠移植瘤病理形態(tài)學(xué) 模型組裸鼠瘤細(xì)胞排列密集紊亂,多見(jiàn)病理性核分裂現(xiàn)象,瘤體較大,壞死較多；敦煌平胃丸組裸鼠瘤細(xì)胞排列紊亂,病理性核分裂象略少,可見(jiàn)多個(gè)核固縮,壞死較少；順鉑組裸鼠瘤細(xì)胞排列紊亂,見(jiàn)多個(gè)核固縮,偶有病理性核分裂象,瘤體較小,壞死少；平胃丸+順鉑組裸鼠瘤細(xì)胞排列紊亂,見(jiàn)多個(gè)核固縮和核碎裂,偶有病理性核分裂象,瘤體小,基本無(wú)壞死。見(jiàn)圖3。

3.4 裸鼠移植瘤凋亡 與模型組比較,各給藥組凋亡率均升高(P＜0.01),以平胃丸+順鉑組更明顯(P＜0.01)。見(jiàn)圖4、表1。

3.5 裸鼠移植瘤凋亡相關(guān)蛋白 與模型組比較,各給藥組caspase 9、caspase3 表達(dá)升高(P＜0.01)；與順鉑組比較,平胃丸+順鉑組caspase 9、caspase3 表達(dá)升高(P＜0.05)；與模型組比較,順鉑組、平胃丸+順鉑組Bcl-2 表達(dá)降低(P＜0.01),而平胃丸組無(wú)明顯變化(P＞0.05)。見(jiàn)圖5、表2。

圖2 各組裸鼠移植瘤體積

圖3 各組裸鼠移植瘤形態(tài)學(xué)（×400）

圖4 各組裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡（×400）

表1 平胃丸聯(lián)合順鉑對(duì)裸鼠移植瘤凋亡率的影響（，n=8）

表1 平胃丸聯(lián)合順鉑對(duì)裸鼠移植瘤凋亡率的影響（，n=8）

注:與模型組比較,**P＜0.01；與順鉑組比較,△△P＜0.01。

3.6 裸鼠脾臟形態(tài)學(xué) 荷瘤不會(huì)引起裸鼠脾指數(shù)及形態(tài)學(xué)的改變。與模型組比較,順鉑組裸鼠脾指數(shù)升高 (P ＜0.01),并破壞脾臟形態(tài)結(jié)構(gòu),HE 染色鏡下可見(jiàn)紅髓、白髓結(jié)構(gòu)不清,淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)破壞,出現(xiàn)多個(gè)巨核細(xì)胞；與順鉑組比較,平胃丸+順鉑組裸鼠脾腫大改善(P＜0.05),部分恢復(fù)了脾臟形態(tài)結(jié)構(gòu),可見(jiàn)紅髓、白髓結(jié)構(gòu),淋巴小結(jié)數(shù)量增多,而平胃丸組不影響脾臟大小和形態(tài)結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖6、表3。

4 討論

胃癌屬于中醫(yī)“噎膈” “癥瘕” “積聚” “伏梁” “心腹痞” “胃脘痛” 范疇,其發(fā)生是一個(gè)邪氣漸深、正氣漸傷的過(guò)程,從正常的胃上皮,經(jīng)歷炎癥、萎縮、腸化生、異型增生,進(jìn)而發(fā)展為胃癌,從起初傷經(jīng)傷氣,到后期傷絡(luò)傷血,最終導(dǎo)致脾虛陽(yáng)陷、凝痰聚瘀、胃失和降。敦煌平胃丸中君藥大黃破癥瘕積聚,留飲宿食,蕩滌腸胃；臣藥附子、干姜溫陽(yáng)散寒；苦參清熱燥濕；藁本、防風(fēng)、桔梗合用既可升發(fā)脾之清陽(yáng)之氣,又可宣利肺氣,布散津液,杜絕水濕形成；土鱉蟲(chóng)活血破瘀,通絡(luò)止痛；人參益氣健脾；玄參養(yǎng)陰；當(dāng)歸養(yǎng)血,全方配伍嚴(yán)謹(jǐn),寒熱并用,虛實(shí)兼顧,氣血同調(diào),可治脾胃陽(yáng)虛、脾不運(yùn)化引起的寒熱錯(cuò)雜、氣滯血瘀和升降失調(diào),臨床上治療慢性萎縮性胃炎及胃脘痛療效顯著[5,7],但鮮有該制劑治療胃癌的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),敦煌平胃丸單用對(duì)胃癌移植瘤的抑制作用明顯,抑瘤率達(dá)45.1%,有望進(jìn)一步從中開(kāi)發(fā)相關(guān)小分子藥物。

表2 平胃丸聯(lián)合順鉑對(duì)裸鼠移植瘤凋亡相關(guān)蛋白的影響（，n=8）

表2 平胃丸聯(lián)合順鉑對(duì)裸鼠移植瘤凋亡相關(guān)蛋白的影響（，n=8）

注:與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與順鉑組比較,ΔP＜0.05,ΔΔ P＜0.01。

圖5 各組裸鼠移植瘤凋亡相關(guān)蛋白（×400）

圖6 各組裸鼠脾臟形態(tài)學(xué)（×400）

表3 平胃丸聯(lián)合順鉑對(duì)裸鼠脾指數(shù)的影響（，n=8）

表3 平胃丸聯(lián)合順鉑對(duì)裸鼠脾指數(shù)的影響（，n=8）

注:與對(duì)照組比較,**P＜0.01；與模型組比較,ΔΔ P＜0.01；與順鉑組比較,#P＜0.05。

腫瘤細(xì)胞中凋亡減弱、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的主要方式之一,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敦煌平胃丸干預(yù)后胃癌移植瘤凋亡率顯著增加,與順鉑聯(lián)用后凋亡率顯著升高,表明該制劑抗胃癌機(jī)制之一是促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡；促凋亡蛋白caspase 9、caspase 3 表達(dá)顯著上調(diào),抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)顯著下調(diào)；聯(lián)用順鉑后,促凋亡蛋白caspase 9、caspase 3表達(dá)顯著升高。凋亡涉及死亡受體介導(dǎo)(外源) 途徑和線粒體(固有) 途徑,各種內(nèi)部刺激(如DNA 損傷、缺氧、氧化應(yīng)激等) 可激活后者,導(dǎo)致線粒體外膜完整性喪失和細(xì)胞色素C 釋放,與Apaf-1、caspase-9 一起形成凋亡小體復(fù)合物,最終導(dǎo)致效應(yīng)胱天蛋白caspase 3 被激活,誘發(fā)細(xì)胞凋亡,并受Bcl-2 家族蛋白的調(diào)控[8],可知caspase-9 是固有凋亡途徑中的啟動(dòng)子caspase,推測(cè)敦煌平胃丸可能通過(guò)復(fù)雜的機(jī)制激活胃癌細(xì)胞內(nèi)caspase-9 依賴(lài)的固有凋亡途徑,最終激活其促進(jìn)細(xì)胞凋亡。大量研究報(bào)道,caspase-9介導(dǎo)的天然化合物引起細(xì)胞凋亡,包括異硫氰酸酯、大黃素、丹參酮ⅡA、熊果酸等[9-10],而敦煌平胃丸中君藥大黃的主要藥效成分大黃素可通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,包括靶向caspase 9[11-12],故可從化合物角度進(jìn)一步探討該制劑促進(jìn)腫瘤凋亡的機(jī)制。

化療藥物會(huì)引起很多不良反應(yīng),如胃腸毒性、骨髓抑制、脾損傷等,從而影響療效,甚至危及患者生命。近年來(lái)研究顯示,中草藥聯(lián)合放化療在腫瘤治療中發(fā)揮了很好的減毒增效作用[13]；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),敦煌平胃丸聯(lián)合順鉑可減輕后者單用造成的脾毒性,表現(xiàn)在減輕化療造成的脾腫大,恢復(fù)脾形態(tài)結(jié)構(gòu),增加淋巴小結(jié)數(shù)量以增強(qiáng)機(jī)體免疫力。脾臟是重要的免疫器官和髓外造血器官,化療期間患者會(huì)出現(xiàn)免疫力低下、血細(xì)胞減少等臨床表現(xiàn),而敦煌平胃丸可以緩解順鉑對(duì)胃癌荷瘤裸鼠造成的脾損傷,與該制劑用藥組方的治法治則符合。

綜上所述,敦煌平胃丸可通過(guò)激活固有凋亡途徑來(lái)抑制胃癌移植瘤的生長(zhǎng),與順鉑聯(lián)用后可增加凋亡,并減緩順鉑造成的脾損傷,但其發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)和具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。今后,可通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接等技術(shù)來(lái)尋找可能的小分子物質(zhì)并進(jìn)行配伍,并采用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探討其療效及機(jī)制,以期為尋找療效顯著、毒性較低的治療胃癌小分子藥物提供方向。