陸 杰王婷婷#梁 琨安 叡王新宏陳 穎

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,上海 201203;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200082)

大承氣湯由大黃、枳實(shí)、厚樸、芒硝組成,是瀉法的代表方劑[1],主治陽(yáng)明腑實(shí)證、里熱實(shí)證、熱結(jié)旁流證,臨床上廣泛用于治療急性胰腺炎[2],不僅可減少急性肺損傷,促進(jìn)急性胰腺炎患者胃腸蠕動(dòng),還能抑制細(xì)胞活性因子、炎癥反應(yīng)[3-6]。前期有人單用大承氣湯于急性胰腺炎動(dòng)物模型,發(fā)現(xiàn)該方可通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮屏障功能來(lái)減輕急性胰腺炎合并腸道毛細(xì)管內(nèi)皮的損傷[7],臨床療效顯著,但其物質(zhì)基礎(chǔ)尚未明確。

中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)一直是中藥現(xiàn)代化研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn),而中藥復(fù)方化學(xué)成分是重要前提[8]。UPLC 與離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜(LTQ-Orbitrap) 聯(lián)用系統(tǒng)已成為分析表征中藥成分的重要技術(shù)[9-10],線性離子阱與Orbitrap傅里葉掃描質(zhì)譜組成的串聯(lián)質(zhì)譜儀將線性離子阱的多級(jí)質(zhì)譜功能與Orbitrap 的高分辨能力結(jié)合起來(lái),在短時(shí)間內(nèi)可實(shí)現(xiàn)母離子、子離子的高分辨采集和多級(jí)質(zhì)譜碎裂,從而顯著提高中藥復(fù)雜體系中化學(xué)成分的快速鑒定與分析能力[11-12]。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 法從大承氣湯中鑒定出73 種成分,包括蒽醌、黃酮、木脂素等,對(duì)研究該方物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制及確保臨床用藥安全有效具有意義。

1 材料

1.1 儀器 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng),配置Ultimate 3000 超高液相色譜儀、LTQ Orbitrap 質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；AL104 型電子天平 (瑞士Mettler-Toledo 公司)；Milli-Q 超純水機(jī)(美國(guó)Millipore 公司)；5424R 型高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf 公司)。

1.2 試劑與藥物 蘆薈大黃素(批號(hào)AB0839-0020)、厚樸酚(批號(hào)AB0682-0020)、柚皮苷(批號(hào)AB1848-0020)、橙皮苷(批號(hào)AB0714-0020)、歐前胡素(批號(hào)AB0831-0020) 對(duì)照品均購(gòu)于成都埃法生物科技有限公司,純度≥98%；大黃素 (批號(hào) B20240)、大黃素甲醚 (批號(hào)B20242)、大黃酸 (批號(hào) B20245)、大黃酚 (批號(hào)B20238)、大黃素-1-O-葡萄糖苷(批號(hào)B27009)、大黃酸-8-O-葡萄糖苷(批號(hào)B20246)、番瀉苷A (批號(hào)B20380)、番瀉苷B (批號(hào)B20381)、沒(méi)食子酸(批號(hào)B20851)、蓮花掌苷(批號(hào)B24363)、綠原酸(批號(hào)B20782)、厚樸木脂體A (批號(hào)B31151)、和厚樸酚(批號(hào)B20498)、柚皮素(批號(hào)B21596)、芹菜素(批號(hào)B20981)、橘皮素(批號(hào)B20646)、橙皮素 (批號(hào) B20184)、蘆丁 (批號(hào)B20771)、檸檬苦素 (批號(hào)B20911)、川陳皮素 (批號(hào)B20199) 對(duì)照品均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司,純度≥98%。大黃(批號(hào)190315-1)、厚樸(批號(hào)190409-1)、芒硝(批號(hào)180910-1) 均購(gòu)于上海萬(wàn)仕誠(chéng)藥業(yè)有限公司；枳實(shí)(批號(hào)190327) 購(gòu)于上海養(yǎng)和堂中藥飲片有限公司,經(jīng)上海虹橋飲片廠陳燕軍主管藥師鑒定為正品,符合2020年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定。色譜純乙腈、甲醇(美國(guó)Dikma公司)；分析純甲醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法

2.1 大承氣湯化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建 通過(guò)檢索TCMSP、TCMID、TCM Database@ Taiwan 數(shù)據(jù)庫(kù),從大承氣湯中收集293 種成分,其中大黃92 種、枳實(shí)65 種、厚樸139 種,并準(zhǔn)確記錄其分子式、精確分子量等信息,構(gòu)建相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.2 色譜條件 Dikma Endeavorsil C18反相色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流動(dòng)相水(含0.1% 甲酸)(A) -乙腈 (B),梯度洗脫 (0～12 min,95%～60% A；12～16.5 min,60%～10% A；16.5～19 min,10% A；19～20 min,10%～90% A；20～21.5 min,90% A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),正負(fù)離子檢測(cè)模式；毛細(xì)管?chē)婌F電壓正離子3.8 kV,負(fù)離子3.2 kV,溫度350 ℃；鞘氣體積流量35 arb；輔助氣體流量15 arb；一級(jí)質(zhì)譜采用全掃描模式,分辨率60 000,m/z 100～1 200；二級(jí)質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴(lài)型掃描模式,分辨率15 000,碰撞誘導(dǎo)解離。

2.4 溶液制備

2.4.1 對(duì)照品溶液 進(jìn)樣前,精密稱(chēng)取大黃素甲醚、大黃酸、大黃酚、大黃酸-8-O-葡萄糖苷、大黃素-1-O-葡萄糖苷、沒(méi)食子酸、蓮花掌苷、柚皮素、柚皮苷、芹菜素、橘皮素、橙皮苷、橙皮素、歐前胡素、蘆丁、檸檬苦素、川陳皮素、綠原酸、厚樸木脂體A 對(duì)照品適量,置于同一量瓶中,甲醇稀釋至10 μg/mL,作為混合對(duì)照品溶液1；另精密稱(chēng)取蘆薈大黃素、大黃素、番瀉苷A、番瀉苷B、厚樸酚、厚樸酚對(duì)照品適量,置于不同量瓶中,甲醇稀釋至10 μg/mL,作為單標(biāo)對(duì)照品溶液,均用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾,備用。

2.4.2 供試品溶液 稱(chēng)取厚樸24 g、枳實(shí)12 g、大黃12 g,前兩者加入360 mL 蒸餾水浸泡30 min,加熱至沸騰狀態(tài),微沸30 min 后500 目濾布過(guò)濾,濾液熱浸后者10 min,前兩者藥渣加入240 mL 蒸餾水煎煮20 min,濾布過(guò)濾,濾液熱浸后者藥渣10 min,合并2 次濾液,趁熱沖入芒硝6 g,攪拌溶解后冷凍干燥,制成生藥量5%的大承氣湯浸膏粉,4 ℃下保存?zhèn)溆?。精密稱(chēng)取1 g,加適量水超聲溶解,精密移取1 mL 置于50 mL 量瓶中,甲醇定容,經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾,即得,取10 μL 進(jìn)樣。

3 結(jié)果

3.1 色譜峰鑒定 構(gòu)建大承氣湯全方數(shù)據(jù)庫(kù)后,對(duì)于有對(duì)照品指認(rèn)的化合物,采取比對(duì)出峰時(shí)間、準(zhǔn)分子離子峰、二級(jí)質(zhì)譜碎片來(lái)鑒定確認(rèn)；對(duì)于沒(méi)有對(duì)照品指認(rèn)的化合物,根據(jù)其精確分子量信息通過(guò)Xcalibur 2.1 工作站得到最可能的分子式(誤差小于1.0×10-5),之后在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索,如有相配匹配的化合物分子式,則采用Mass frontier 7.0 軟件進(jìn)行裂解規(guī)律預(yù)測(cè),對(duì)比二級(jí)質(zhì)譜碎片信息進(jìn)行確認(rèn),通過(guò)Mass Frontier 7.0 軟件分析二級(jí)碎片峰裂解規(guī)律,將化合物mol 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入軟件中進(jìn)行模擬碎裂,找出相關(guān)信息,分析可能的裂解途徑,從而驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性。

結(jié)果,從大承氣湯中快速鑒定出73 個(gè)化合物,包括16個(gè)黃酮、23 個(gè)蒽醌、13 個(gè)木脂素、6 個(gè)酚類(lèi)、2 個(gè)生物堿、5 個(gè)香豆素、8 個(gè)其他類(lèi),UPLC-LTQ-Orbitrap-MSn總離子流圖見(jiàn)圖1,保留時(shí)間、分子式、化合物名稱(chēng)等數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

圖1 大承氣湯UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 總離子流圖

3.2 主要化合物分析鑒定

3.2.1 蒽醌 采用Xcalibur 軟件擬合出大黃素m/z 269.044 44 [M-H]-,與圖1 中49 號(hào)峰準(zhǔn)分子離子峰m/z 269.044 83 的相對(duì)誤差為1.413×10-6,同時(shí)其二級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生碎片離子m/z 225.06 [M-H-CO2]-、241.05 [M-HCO]-,與大黃素對(duì)照品保留時(shí)間、裂解規(guī)律相同,也與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致,故推測(cè)為大黃素,其二級(jí)質(zhì)譜圖和裂解規(guī)律見(jiàn)圖2。

表1 大承氣湯化學(xué)成分鑒定結(jié)果

續(xù)表1

圖2 大黃素二級(jí)質(zhì)譜圖及其裂解途徑

采用Xcalibur 軟件擬合出大黃酸m/z 283.023 71 [MH]-,與圖1 中60 號(hào)峰準(zhǔn)分子離子峰m/z 283.024 29 的相對(duì)誤差為2.034×10-6,同時(shí)其二級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生碎片離子m/z 239.03 [M-H-CO2]-,與大黃酸對(duì)照品保留時(shí)間、裂解規(guī)律相同,也與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致,故推測(cè)為大黃酸,其二級(jí)質(zhì)譜圖和裂解規(guī)律見(jiàn)圖3。

采用Xcalibur 軟件擬合出番瀉苷A m/z 861.187 27 [MH]-,與圖1 中28 號(hào)峰準(zhǔn)分子離子峰m/z 861.186 16 的相對(duì)誤差為-1.11×10-6,同時(shí)其二級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生碎片離子m/z 699.13、537.08,分別為母離子丟失1、2 個(gè)葡萄糖苷所得,與番瀉苷A 對(duì)照品的保留時(shí)間、裂解規(guī)律相同,也與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致,故推測(cè)為番瀉苷A,其二級(jí)質(zhì)譜圖和裂解規(guī)律見(jiàn)圖4。

圖3 大黃酸二級(jí)質(zhì)譜圖及其裂解途徑

3.2.2 黃酮 圖1 中19 號(hào)峰的一級(jí)質(zhì)譜在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 579.170 84,其保留時(shí)間與柚皮苷對(duì)照品一致,而且其二級(jí)質(zhì)譜中m/z 271.06 [M-H-Rha-Glc]-與柚皮苷對(duì)照品裂解信息相同,也與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致,故確定為柚皮苷。圖1 中22 號(hào)峰在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 609.144 84 [M-H]-,采用Xcalibur 軟件擬合出蘆丁m/z 609.145 01 [M-H]-,相對(duì)誤差為-0.171×10-6,同時(shí)其二級(jí)質(zhì)譜中存在m/z 301.04 [MH-Rha-Glc]-等碎片離子,與蘆丁對(duì)照品的保留時(shí)間、裂解規(guī)律相同,也與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致,故推測(cè)為蘆丁,其二級(jí)質(zhì)譜圖和裂解規(guī)律見(jiàn)圖5。

圖4 番瀉苷A 二級(jí)質(zhì)譜圖及其裂解途徑

圖5 蘆丁二級(jí)質(zhì)譜圖及其裂解途徑

3.2.3 木脂素 圖1 中68 號(hào)峰的保留時(shí)間為14.24 min,在負(fù)離子模式下其一級(jí)質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰為m/z 265.122 16 [M-H]-,同時(shí)其二級(jí)質(zhì)譜中存在m/z 247.11 [M-H-H2O]-碎片離子,與厚樸酚對(duì)照品保留時(shí)間、裂解規(guī)律相同,也與文獻(xiàn)[18]報(bào)道一致,故推測(cè)為厚樸酚,其二級(jí)質(zhì)譜圖和裂解規(guī)律見(jiàn)圖6。

3.2.4 其他類(lèi) 圖1 中33 號(hào)峰在正離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰為m/z 471.202 61 [M+H]+,采用Xcalibur擬合出其檸檬苦素m/z 471.201 34 [M+H]-,相對(duì)誤差為2.686×10-6,同時(shí)其二級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生碎片離子m/z 425.20[M+H-CH2O2]+、367.19 [M+H-2CH3-H2O]+、339.20[M+H-CH2O2-2CH3-H2O-CO]+,與檸檬苦素對(duì)照品保留時(shí)間、裂解規(guī)律相同,也與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致,故推測(cè)為檸檬苦素,其二級(jí)質(zhì)譜圖和裂解規(guī)律見(jiàn)圖7。

圖6 厚樸酚二級(jí)質(zhì)譜圖及其裂解途徑

圖7 檸檬苦苷二級(jí)質(zhì)譜圖及其裂解途徑

4 討論

中藥復(fù)方作用的特點(diǎn)是多成分、多靶點(diǎn)相互作用,故單一成分并不能體現(xiàn)其實(shí)際療效。中藥質(zhì)量控制應(yīng)聚焦全方中最大限度代表藥效的化學(xué)成分,構(gòu)建以藥效成分為指導(dǎo)的相關(guān)體系。

UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 具有高分離度、高靈敏度、高精密度的特點(diǎn),在樣品分析過(guò)程中可實(shí)現(xiàn)一級(jí)質(zhì)譜MS 和多級(jí)質(zhì)譜MSn同步采集,得到一級(jí)質(zhì)譜分子離子峰、二級(jí)碎片離子,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)方中化學(xué)成分的快速分析鑒定的目的。本實(shí)驗(yàn)采用該方法從大承氣湯中快速鑒定出73 個(gè)化合物,主要為黃酮、蒽醌、木脂素等,其中蒽醌類(lèi)化合物在選擇性離子碰撞誘導(dǎo)解離中的主要裂解方式是失去母核基團(tuán)中CO,并保留共軛體系,其側(cè)鏈取代基 (主要為OH、CH3、OCH3、COOH) 容易以H2O、CH3、CH2、CO2等中性小分子片段的形式丟失；黃酮類(lèi)化合物中黃酮苷的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)主要是與葡萄糖或鼠李糖等形成氧苷,在質(zhì)譜高能碰撞下苷鍵連續(xù)斷裂,丟失糖基,生成高強(qiáng)度的黃酮苷元碎片；木脂素類(lèi)化合物中厚樸酚特征離子峰m/z 247 形成了π-π 共軛體系,使其結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定,在質(zhì)譜圖中的豐度較高。

5 結(jié)論

UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 法可快速、準(zhǔn)確地對(duì)大承氣湯中化學(xué)成分進(jìn)行定性分析,從而全面闡明其成分組成。結(jié)果,從中鑒定出73 個(gè)化合物,包括16 個(gè)黃酮、23 個(gè)蒽醌、13 個(gè)木脂素、6 個(gè)酚類(lèi)、2 個(gè)生物堿、5 個(gè)香豆素及其他成分,可為該方臨床應(yīng)用及質(zhì)量控制提供參考。