白云娥張沙沙 張芮銘高建平侯 靜李建寬雷振宏王玉龍肖淑賢

(1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室,山西 太原 030001;2.山西振東道地藥材開發(fā)有限公司,山西 長治 047100;3.山西省心血管病醫(yī)院藥學(xué)部,山西 太原 030024)

黨參為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf.、素花黨 參 Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta (Nannf.) L.T.Shen 或川黨參Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根[1],是常用藥材,始載于清代《本草從新》,有補(bǔ)中益氣、健脾益肺的功能,臨床上常用于脾肺虛弱、氣短心悸、食少便溏、虛喘咳嗽、內(nèi)熱消渴等癥,主要分布于山西、甘肅、陜西、四川、湖北等省。黨參化學(xué)成分較為復(fù)雜,主要有多糖、苷類、甾醇類、生物堿、揮發(fā)油、三萜類成分等,黨參炔苷是《中國藥典》 中黨參的鑒別指標(biāo),浸出物是黨參質(zhì)量的評價指標(biāo)[2-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黨參多糖是黨參藥材中主要的化學(xué)成分[4],同時也是發(fā)揮黨參藥效作用的重要成分之一[5-7]。

在2020 年版《中國藥典》 一部黨參的規(guī)定中,黨參飲片除米炒黨參水分低于“藥材” 外,其他項均以“同藥材” 規(guī)定。中藥飲片源于藥材而不同于藥材,為了客觀的評價中藥飲片“同藥材” 的規(guī)定,本實驗以不同產(chǎn)地黨參藥材、飲片及米炒黨參為樣品,從浸出物、多糖、HPLC 指紋圖譜的特征峰及其相對峰面積3 方面,利用現(xiàn)代分析技術(shù)及統(tǒng)計學(xué)方法對黨參藥材-飲片-米炒黨參的質(zhì)量進(jìn)行了等同性研究[8-9],以期為合理評價黨參藥材-飲片-米炒黨參的質(zhì)量和黨參的加工炮制工藝研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 752-紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KDM 型控溫電熱套(山東鄴城花魯儀器公司)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-S 恒溫水浴鍋(蘇州威爾實驗用品有限公司)；DGF30-IA 電熱鼓風(fēng)干燥箱(南京實驗儀器廠)；BS-124S 電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；LC-20AT 高效液相色譜儀(日本島津公司)；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試劑與藥物 無水葡萄糖對照品(純度≥99%,批號BWB50153,北京北方偉業(yè)計量技術(shù)研究院,北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司聯(lián)合監(jiān)制)；黨參炔苷對照品(純度≥98%,批號MUST-1301-2901,成都曼斯特生物有限公司)。甲醇(色譜純,天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)；乙腈(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)；甲醇(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)；95%乙醇(分析純,河南省新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司)；苯酚(分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；濃硫酸(分析純,北京化工廠)；水為三蒸水。

1.3 藥材 2017 年6 月、8 月分別于黨參主產(chǎn)區(qū)山西省長治市平順縣、壺關(guān)縣及晉城市陵川縣收集32 批黨參藥材、36 批黨參飲片及8 批米炒黨參,經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)白云娥副教授鑒定為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula (Franch) Nannf.的干燥根,標(biāo)本(201610-01) 及樣品存于山西醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)研究室標(biāo)本庫,具體信息見表1。

2 方法

2.1 浸出物測定 按2020 年版《中國藥典》[1](通則2201) 醇溶性浸出物測定法項下熱浸法測定,結(jié)果見表1。

2.2 多糖測定 在課題組前期研究基礎(chǔ)上,采用苯酚-硫酸法[10]測定。精密移取供試品溶液0.1 mL,加入蒸餾水至2.0 mL,再加入1.0 mL 5% 苯酚,搖勻,迅速精密加入5 mL 濃硫酸,搖勻,置沸水浴中加熱15 min,冷卻至室溫,在490 nm 波長處測吸光度,計算多糖含有量,結(jié)果見表1。

表1 黨參信息及測定結(jié)果（n=3）Tab.1 Codonopsis Radix information and determination results （n=3）

續(xù)表1

2.3 HPLC 指紋圖譜建立 在課題組前期研究基礎(chǔ)上[11],按2020 年版《中國藥典》 通則0512 建立樣品HPLC 指紋圖譜,并以黨參炔苷為參照峰,對76 批樣品的7 種特征成分(特征峰) 相對峰面積進(jìn)行了測定。

2.3.1 色譜條件 InertSustainl C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相乙腈 (A) -0.1%磷酸 (B)；體積流量0.80 mL/min；柱溫25.0 ℃；檢測波 長220 nm；梯度洗 脫 (0～10 min,5%～10% A；10～30 min,10%～15% A；30～50 min,15%～20%A；50～65 min,20%～30%A；65～75 min,30%～50%A；75～80 min,50%～70%A；80～85 min,70%A)；進(jìn)樣量20 μL。

2.3.2 對照品溶液制備 取黨參炔苷對照品約2 mg,精密稱定,置于10 mL 量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,即得。

2.3.3 供試品溶液制備 取藥材粉末約1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加25 mL 甲醇,超聲(40 kHz,200 W) 提取30 min,取出,放冷,濾過,用10 mL甲醇洗滌錐形瓶,濾過,合并濾液,濾液減壓蒸干,殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。吸取各供試品溶液,在“2.3.1” 項條件下進(jìn)樣,記錄105 min 的色譜圖。

2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Excel、SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件,進(jìn)行單因素方差分析和聚類分析。

3 結(jié)果

3.1 浸出物與多糖含有量

3.1.1 單因素方差分析 運用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件對黨參藥材、飲片及米炒黨參的浸出物、多糖含有量進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果,只有黨參藥材與米炒黨參、飲片與米炒黨參浸出物之間有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)；黨參藥材、飲片及米炒黨參的多糖含有量均值處于同一列,表明三者在多糖含有量方面無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

3.1.2 質(zhì)量等同性分析 為了進(jìn)一步分析評價黨參藥材、飲片及米炒黨參的質(zhì)量,課題組參考文獻(xiàn)[12],以浸出物、多糖含有量為指標(biāo),按飲片或米炒黨參所測含有量占藥材或飲片中含有量的比例,評價76 批7 個產(chǎn)地樣品之間的質(zhì)量等同性。結(jié)果,76 批樣品在浸出物、多糖含有量方面的質(zhì)量等同性較好,均大于90%,表明其大體一致,見表2。

表2 黨參藥材、黨參飲片及米炒黨參的質(zhì)量等同性（%）Tab.2 Quality equivalence of Codonopsis Radix，Codonopsis Radix pieces and rice fried Codonopsis Radix （%）

3.1.3 聚類分析 采用SPSS 22.0 軟件,以浸出物與多糖含有量為指標(biāo),對樣品中同來源、同產(chǎn)地、同等級部位的21 批黨參藥材-飲片-米炒黨參進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果,按浸出物和多糖含有量聚類分析時未能將藥材、飲片、米炒,表明浸出物和多糖含有量的差別不足以區(qū)三者見圖1。

圖1 21 批樣品中浸出物及多糖含有量聚類分析Fig.1 Cluster analysis of the contents of extract and polysaccharide in twenty-one batches of samples

3.2 HPLC 指紋圖譜

3.2.1 指紋圖譜建立及指認(rèn) 在“2.3.1” 項色譜條件下分別建立了黨參藥材(n=32)、黨參飲片(n=36) 及米炒黨參(n=8) 的HPLC 指紋圖譜,采用國家藥典委員會編寫的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A 版) 軟件進(jìn)行分析,分別生成三者共有模式的對照指紋圖譜R、R1、R2,包括7 個主要特征峰。通過對照品指認(rèn)出5 個特征峰,即1 號峰為codonopyrrolidium B,3 號峰為京尼平苷,4 號峰為黨參苷Ⅰ,5 號峰為黨參炔苷,7號峰為蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ,其中5 號峰峰面積相對較大,重復(fù)性好,故作為參照峰,標(biāo)記為S。HPLC 指紋圖譜及共有模式對照指紋圖譜見圖2～4。

圖2 黨參藥材色譜圖Fig.2 Chromatograms of Codonopsis Radix

圖3 黨參飲片色譜圖Fig.3 Chromatograms of Codonopsis Radix pieces

圖4 米炒黨參色譜圖Fig.4 Chromatograms of rice fried Codonopsis Radix

3.2.2 相似度分析 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A 版) 軟件,分析黨參藥材、黨參飲片及米炒黨參對照指紋圖譜的相似度。結(jié)果,黨參藥材與黨參飲片、黨參藥材與米炒黨參、黨參飲片與米炒黨參的相似度較高,分別為0.966、0.925、0.893,見表3、圖5。

3.2.3 相對峰面積比較 采用SPSS 20.0 軟件,比較黨參藥材、黨參飲片及米炒黨參7 個特征峰的相對峰面積。結(jié)果,黨參藥材與黨參飲片3、4、6號峰相對峰面積有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),見表4～5、圖6。

表3 黨參藥材、黨參飲片及米炒黨參對照指紋圖譜相似度比較Tab.3 Comparison of similarities among the reference fingerprints of Codonopsis Radix，Codonopsis Radix pieces and rice fried Codonopsis Radix

圖5 黨參藥材、黨參飲片及米炒黨參對照指紋圖譜Fig.5 Reference fingerprints of Codonopsis Radix，Codonopsis Radix pieces and rice fried Codonopsis Radix

表4 76 批樣品7 個特征峰相對峰面積Tab.4 Relative peak areas of seven characteristic peaks of seventy-six batches of samples

3.2.4 聚類分析 采用SPSS 20.0 軟件,以7 個特征峰相對峰面積為指標(biāo),對樣品中同來源、同產(chǎn)地、同等級部位的21 批黨參藥材-飲片-米炒黨參進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果,按7 個特征峰的相對峰面積聚類時未能將三者區(qū)分開,不足以將其歸類,見圖7。

圖6 76 批樣品7 個特征峰相對峰面積比較Fig.6 Comparison of relative peak areas of seven characteristic peaks of seventy-six batches of samples

表5 76 批樣品7 個特征峰相對峰面積的單因素方差分析Tab.5 One-way analysis of variance of seven characteristic peaks of seventy-six batches of samples

4 討論

圖7 7 個特征峰相對峰面積聚類分析Fig.7 Cluster analysis of relative peak areas of seven characteristic peaks

本研究是基于2020 年版《中國藥典》 中對飲片的評價——“同藥材” 的描述,以黨參為例,從浸出物、多糖、HPLC 指紋圖譜及特征峰相對峰面積3 方面進(jìn)行黨參藥材-飲片-米炒黨參的質(zhì)量等同性研究。

4.1 浸出物 藥材與米炒黨參、飲片與米炒黨參有統(tǒng)計學(xué)差異,而且從藥材-飲片-米炒黨參有下降的趨勢,提示黨參浸出物是評價黨參質(zhì)量的重要功能性指標(biāo),產(chǎn)地加工和米炒炮制對浸出物含有量有影響[13]。應(yīng)加強(qiáng)對黨參炮制工藝的研究,規(guī)范炮制工藝,避免浸出物流失,影響中藥質(zhì)量及療效。但黨參藥材、飲片、米炒黨參的質(zhì)量等同性分析表明,黨參飲片或米炒黨參的醇浸出物含有量占藥材或飲片中醇浸出物含有量的百分?jǐn)?shù)均數(shù)都大于90%,表明黨參藥材-飲片-米炒黨參的質(zhì)量等同性較好。

4.2 多糖含有量 藥材-飲片-米炒黨參三者之間均無統(tǒng)計學(xué)差異,但有下降的趨勢,這與文獻(xiàn)[14-16]報道的米炒黨參多糖含有量減少的結(jié)果一致。提示樣品目前的產(chǎn)地加工和米炒炮制方法,對多糖含有量的影響不大。這與黨參藥材、飲片、米炒黨參的質(zhì)量等同性分析是一致的。

4.3 HPLC 指紋圖譜 黨參藥材-飲片-米炒黨參之間的HPLC 對照指紋圖譜相似度均大于0.800[17],而黨參藥材與飲片在3 號、4 號及6 號峰相對峰面積方面有統(tǒng)計學(xué)差異,提示產(chǎn)地加工及炮制對三者的化學(xué)成分種類影響不大[18],但對藥材-飲片二者之間的3 號(京尼平苷)、4 號(黨參苷Ⅰ) 及6號峰(未知) 3 種成分的含有量有影響[19-20],有下降趨勢。

實驗前期對76 批樣品以浸出物、多糖含有量、特征峰相對峰面積為指標(biāo),對黨參藥材、飲片及米炒黨參樣本進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,但沒有規(guī)律性結(jié)果。隨后,對21 批不同產(chǎn)地的黨參藥材、飲片及米炒黨參又進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,還是未能將藥材、飲片、米炒3 種黨參分開,且3 種樣品HPLC 對照指紋圖譜的相似度在0.893～0.966 之間,提示浸出物、多糖含有量、7 個特征峰相對峰面積3 個指標(biāo),不足以聚類區(qū)分黨參藥材、飲片及米炒黨參,后期將對黨參藥材、飲片及米炒黨參的HPLC 特征峰進(jìn)行進(jìn)一步指認(rèn)及定量研究。

綜上所述,黨參藥材、飲片及米炒黨參的質(zhì)量等同性較好；2020 年版《中國藥典》 一部中黨參項下對飲片中浸出物的評價——“同藥材” 的規(guī)定是合理的,但對米炒黨參的規(guī)定,值得進(jìn)一步研究；加工炮制對浸出物及HPLC 特征峰的含有量是有影響的。該研究為合理評價黨參藥材-飲片-米炒黨參的質(zhì)量提供了一種新思路,為黨參的進(jìn)一步加工炮制研究奠定了一定基礎(chǔ)。