陳 帥,王 亮,齊絨絨,陳春雪,姜茹新,鐘方麗

(吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院,吉林 吉林 132022)

羅布麻葉又名澤漆麻、紅根草、野茶葉、茶葉花、野麻等,為夾竹桃科植物羅布麻Apocynum venetum L.的干燥葉,主要分布于我國吉林、內(nèi)蒙古、河北、新疆、河南等地。藥用羅布麻葉一般在夏季采收,除去雜質(zhì),干燥即得。2020 年版《中國藥典》 記載其性味甘、苦,涼,歸肝經(jīng),具有平肝安神、清熱利水之功效,臨床上主要用于肝陽眩暈、心悸失眠、浮腫尿少等癥[1-2]。明代《救荒本草》 記載澤漆(羅布麻葉) 采嫩葉,蒸過,曬干,做茶吃亦可；《本草綱目》 記載羅布麻葉具有強心利水,主治四肢面目浮腫、利大小腸、明目輕身的功效[2-4]。目前國內(nèi)已經(jīng)開發(fā)出以羅布麻葉為原料的茶、片劑、膠囊劑、顆粒劑等多種保健產(chǎn)品,主要用于調(diào)節(jié)血壓、等心血管疾病的輔助治療[5-8]?，F(xiàn)代分離分析表明羅布麻葉中含有黃酮類、鞣質(zhì)、有機酸類、皂苷類、揮發(fā)油等多種成分,其中黃酮類和有機酸類為其主要藥效成分[9-12]。目前,2020 年版《中國藥典》 一部中僅對HPLC 法測定羅布麻葉中金絲桃苷的含有量進行了規(guī)定,這顯然無法全面反映藥材的質(zhì)量。文獻(xiàn)中常見采用HPLC 法測定羅布麻制劑中一種或多種成分的含有量[13-15],徐碩等[16]采用一測多評法結(jié)合HPLC 對羅布麻葉中6 種黃酮類成分進行含有量測定。UPLC 法較HPLC 法分析速度更快,靈敏度更高,節(jié)約溶劑,本研究采用UPLC 法同時測定羅布麻葉中7 種成分的含有量,以期為進一步完善其質(zhì)量控制體系提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 ACQUITY UPLC H-CLASS (配置四元溶劑管理器、樣品管理器FTN、PDA 檢測器)、Empower 3 軟件(美國Waters 公司)；MS105 電子分析天平(十萬分之一,瑞士Mettler-Toleduo 公司)；KQ-5200DE 超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；H1850 臺式高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；1000Y 高速多功能粉碎機(永康市鉑歐五金制品有限公司)。

1.2 試劑與藥物 羅布麻葉共20 批,均購自長春市、吉林市各大藥房,由吉林化工學(xué)院鐘方麗教授鑒定為正品,具體信息見表1。綠原酸 (批號MUST-18092022,純度99.10%)、金絲桃苷(批號MUST-1603213,純度98.36%)、異槲皮苷(批號MUST-18051005,純度99.74%)、槲皮苷 (批號MUST-16120510,純度99.19%)、槲皮素 (批號MUST-17101104,純度99.35%)、山柰酚 (批號MUST-14110508,純度99.8%) 對照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純；其他試劑均為分析純；水為屈臣氏純化水。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；流動相乙腈(A) -0.2%甲酸(B),梯度洗脫(0～1 min,5%～9%A；1～1.6 min,9%～10%A；1.6～2 min,10%～13%A；2～5 min,13%～14% A；5～8 min,14% A；8～10 min,14%～30% A；10～11 min,30%～45%A；11～11.5 min,45%～60% A；11.5～12 min,60%～90%A；12～12.5 min,90～5% A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫38 ℃；檢測波長,金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚均為360 nm,綠原酸為326 nm；進樣量1 μL。

2.2 對照品溶液制備 分別精密稱取綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚對照品適量,加甲醇稀釋至刻度線,制備成質(zhì)量濃度分別為164、390、380、72、800、198、100 μg/mL 的對照品溶液,分別精密吸取上述對照品溶液1 mL,置于同一量瓶中,甲醇稀釋至刻度,即得混合對照品貯備液,將貯備液稀釋至原質(zhì)量濃度的1/2.5、1/5、1/6.25、1/10、1/20,即得。

2.3 供試品溶液制備 取藥材約1.0 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入50% 甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,超聲(53 kHz、250 W) 處理30 min,放冷,50% 甲醇補足減失質(zhì)量,搖勻,12 000 r/min 離心5 min,取上清液,0.22 μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

2.4 專屬性實驗 取“2.2” “2.3” 項下溶液及空白流動相,在“2.1” 項色譜條件下進樣分析,記錄色譜圖,見圖1。由此可知,供試品溶液中各待測成分色譜峰與其他峰的分離度均大于1.5,表明該方法專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察 分別吸取“2.2” 項下系列質(zhì)量濃度混合對照品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣,記錄色譜圖。以各對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y) 進行回歸,得到回歸方程,以信噪比(S/N) 為3 時對照品質(zhì)量濃度為檢出限,以S/N 為10 時對照品質(zhì)量濃度為定量限,結(jié)果見表2,表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗 取同一混合對照品溶液,在“2.1” 項色譜條件下連續(xù)進樣6 次,記錄色譜圖,測得綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚峰面積RSD 分別為1.28%、1.05%、1.33%、0.98%、1.27%、1.64%、1.41%,表明儀器精密度良好。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液(批號20180201),室溫下放置,在“2.1” 項色譜條件下于0、2、4、6、8、10 h 進樣,記錄色譜圖,測得綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚峰面積RSD 分別為1.05%、1.14%、1.08%、1.54%、1.29%、1.38%、1.35%,表明供試品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗 取同一批藥材 (批號20180201) 6 份,每份1.0 g,按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項下色譜條件下進樣,記錄色譜圖,測得綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚峰面積RSD 分別為 1.73%、1.66%、1.52%、1.89%、1.67%、1.84%、1.61%,表明該方法重復(fù)性良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已測定的藥材(批號20180201) 粉末6 份,每份0.5 g,置于具塞錐形瓶中,分別精密加入各對照品溶液適量,按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣,記錄色譜圖,得綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的平均加樣回收率分別為98.5%、98.1%、105.0%、98.0%、103.0%、98.7%、95.6%,RSD 分別為1.5%、1.9%、1.1%、1.6%、1.5%、1.9%、2.0%。

2.10 樣品含有量測定 按“2.3” 項下方法制備20 批藥材供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣,記錄色譜圖,計算各成分的含有量,結(jié)果見表3。

從表3 中可以看出,20 批藥材中綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的含有量范圍分別為4.269～6.694、0.646～1.440、0.630～1.529、0.090～0.363、0.136～0.337、0.076～0.263、0.005～0.072 mg/g,反映出不同批次樣品中7 種成分的含有量均存在明顯差異,含有量波動最小的為綠原酸(RSD 12.7%),其中產(chǎn)地為河北的S16 樣品中最高(6.694 mg/g),而產(chǎn)地為新疆的S2、S4、S5、S7、S8、S17 樣品中相對穩(wěn)定(平均值6.061 mg/g,RSD 3.7%)；含有量波動最大的是山柰酚(RSD 63.5%),其中產(chǎn)地為新疆的S1 樣品中最高(0.072 mg/g),且產(chǎn)地為新疆的S2、S4、S5、S7、S9、S19 樣品中相對穩(wěn)定(平均值0.025 5 mg/g,RSD 11.2%)。

利用Unscrambler X 軟件對含有量測定結(jié)果數(shù)據(jù)進行處理,采用系統(tǒng)聚類分析方法的組間法,以7 種成分的含有量為變量,各批編號及產(chǎn)地為標(biāo)注個案,平方Euclidean 距離為度量標(biāo)準(zhǔn),對20 批樣品進行聚類分析,結(jié)果見圖2。

圖2 顯示,當(dāng)分類距離大于3.5 時,20 批樣品被明顯地分為3 大類(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),其中被劃為Ⅰ類 的樣品包括S3、S11、S15、S18、S19、S20,S1、S6、S10、S12、S13 被劃為Ⅲ類,而其余樣品被劃分為Ⅱ類。其中,產(chǎn)地為新疆的樣品S2、S4、S5、S7、S8、S9、S17 被集中劃分為Ⅱ類,表明當(dāng)?shù)厮幉乃G原酸等7 種成分的含有量相對穩(wěn)定。

表3 各成分含有量測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents （mg/g，n=3）

圖2 20 批樣品聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of twenty batches of samples

3 討論

3.1 測定指標(biāo)確定 羅布麻葉中含有黃酮和有機酸類化合物,通過檢索文獻(xiàn)和課題組前期研究工作,發(fā)現(xiàn)黃酮類、有機酸類化合物都是羅布麻葉中重要的藥效成分[6,8,10,17-19],而目前羅布麻葉藥材僅以金絲桃苷作為控制質(zhì)量的指標(biāo)[1],無法真實反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量。本研究對羅布麻葉中6 種黃酮類和1 種有機酸類成分進行含有量測定,7 種成分均可以作為羅布麻葉含有量測定的指標(biāo)成分,從而改善了指標(biāo)成分單一的缺點,以期為羅布麻葉藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

3.2 色譜條件優(yōu)化 本實驗考察了ACQUITY UPLC HSS C18SB 1.8 μm、CORTECS UPLC Shield RP181.8 μm、ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm 色譜柱后發(fā)現(xiàn)ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm 色譜柱出峰效果較好；流動相考察了甲醇-水、甲醇-水(含0.1%甲酸)、甲醇-水(含0.2%甲酸)、乙腈-水、乙腈-水(含0.1%甲酸)、乙腈-水(含0.2%甲酸) 6 種流動相系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)采用前3 種流動相洗脫時,色譜峰峰型較差,分析時間長,各色譜峰與相鄰色譜峰分離度不佳,當(dāng)換用乙腈-水作為流動相時,各成分色譜峰峰型明顯改善,整體分析時間也縮短,各色譜峰與相鄰色譜峰分離度也明顯改善,在換用乙腈-水(含0.1% 甲酸) 后,除金絲桃苷和異槲皮苷外的色譜峰均與相鄰色譜峰達(dá)到基線分離,繼續(xù)加大水相中甲酸的濃度,即采用乙腈-水(含0.2% 甲酸) 時,金絲桃苷和異槲皮苷二者也達(dá)到了基線分離,且所有待測組分色譜峰峰型較好,樣品分析時間適中。

3.3 結(jié)果分析 含有量測定結(jié)果顯示,不同產(chǎn)地的20 批羅布麻葉飲片中7 種成分的含有量存在顯著差異,可能與地區(qū)生態(tài)環(huán)境、采收時間、炮制工藝和儲藏條件等有關(guān)。此外,聚類分析結(jié)果顯示20 批樣品被聚為三類,其中產(chǎn)地為新疆的10 批樣品中有7 批被集中劃分為Ⅱ類,表明來源于新疆的樣品中7 種成分的含有量相對穩(wěn)定。

本實驗建立UPLC 法同時測定羅布麻葉中7 種成分的含有量,該方法分析速度快、準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定性好,結(jié)合聚類分析,可初步判斷羅布麻葉藥材質(zhì)量的優(yōu)劣,以期為羅布麻葉藥材質(zhì)量控制的進一步完善提供依據(jù)。