胡 倩 薛鵬輝于 弘王 敏趙新春邱 峰周光飚*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 102488;2.國(guó)家癌癥中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021;3.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100101;4.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,天津 301617)

鵝不食草Centipeda minima (L.) A.Br.et Aschers.是菊科植物,分布廣泛,藥用歷史悠久,為常用中藥材,其氣微香,久嗅有刺激感,味苦、微辛,性溫,歸肺經(jīng),具有發(fā)散風(fēng)寒、通鼻竅、止咳功效,適用于風(fēng)寒頭痛、咳嗽痰多、鼻塞不通、鼻淵流涕等癥狀,具有抗炎、抗菌、抗過敏、神經(jīng)保護(hù)作用[1-5]。課題組前期報(bào)道了鵝不食草單體的抗癌作用[6],并首次發(fā)現(xiàn)從中提取的化合物6-氧-當(dāng)歸酰多梗白菜菊素在細(xì)胞、動(dòng)物模型均顯示顯著的抗肺癌活性,其機(jī)理是和蛋白泛素連接酶E3 復(fù)合物(Skp1-Cullins-F-box E3,SCF E3) 的基本成分細(xì)胞周期S 期激酶相關(guān)蛋白1 (S-phase kinase associated protein,Skp1) 及具有促癌活性的信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3 (signal transduction and activators of transcription 3,STAT3) 結(jié)合,導(dǎo)致促癌性E3連接酶間變性淋巴瘤激酶核相互作用伴侶(nuclear-interacting partner of anaplastic lymphoma kinase,NIPA)、S 期激酶相關(guān)蛋白2 (S-phase kinase associated protein 2,Skp2)、β-轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)相容蛋白 (beta transducinrepeats containingproteins,β-TRCP) 從Skp1 解離而降解失活,而STAT3 活性受抑制使Skp2 活性進(jìn)一步受抑制,引起肺癌細(xì)胞周期阻滯在有絲分裂期[7-8]。為了解鵝不食草是否還含有其他活性較強(qiáng)的抗肺癌物質(zhì),本實(shí)驗(yàn)體外檢測(cè)了32 個(gè)單體化合物抗肺癌細(xì)胞活性,以期為該藥材相關(guān)作用的進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 32 種鵝不食草單體化合物(CM-1～CM-32) 由天津中醫(yī)藥大學(xué)邱峰教授實(shí)驗(yàn)室提供,純度均達(dá)99%以上。RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gilbco 公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公 司；噻唑藍(lán) [3-(4,5) -dimethylthiahiazo (-z-y1) -3,5-diphenytetrazoliumromide,MTT]、二甲基亞砜 (DMSO) 購(gòu)自美國(guó)Amresco 公司；Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗Cleaved caspase-3、caspase-8、PARP、ERK、p-ERK(Thr202/Tyr204)、AKT、p-AKT (Ser473)、NFκB 抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；抗β-Actin 抗體、脫脂奶粉均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。

1.2 儀器 酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek 公司)；倒置相差熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific 公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD 公司)；蛋白電泳儀及濕式蛋白電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.3 細(xì)胞 肺癌細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù),在37 ℃、含5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中,A549 用加入10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培 養(yǎng),NCI-H1975、NCI-H1299、NCI-H460、NCIH520 用加入10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2 方法

2.1 化合物配制 32 種鵝不食草單體化合物均溶于DMSO,配成濃度為20 mmol/L 的母液,保存于-20 ℃。使用時(shí)稀釋并加入到細(xì)胞培養(yǎng)基,調(diào)整至化合物終濃度為1～20 μmol/L。

2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,胰酶消化細(xì)胞計(jì)數(shù)后,調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個(gè)/mL,用96 孔板鋪板,每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液；待細(xì)胞完全貼壁后換上含有相應(yīng)藥物濃度梯度的新鮮培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。測(cè)前3 h 加10 μL MTT 溶液,用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 波長(zhǎng)處吸光度值并計(jì)算細(xì)胞存活率及半數(shù)抑制濃度(IC50)[9]。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 消化要檢測(cè)的細(xì)胞(每個(gè)樣品約1.5×105個(gè)細(xì)胞),PBS 洗2 遍,每次用1 000 g 離心5 min 后去上清,收集細(xì)胞,加入195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞,每個(gè)樣品加入3 μL FITC-Annexin V 染料輕輕混勻,室溫避光孵育10～20 min,隨后置于冰浴上,孵育過程中可以重懸細(xì)胞2～3 次以改善染色效果。上機(jī)前加入5 μL 溴化乙啶染料,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡的肺癌細(xì)胞比例。

2.4 免疫印跡 取等量蛋白樣品于12% SDSPAGE 膠上樣,先80 V 恒壓電泳15 min,待樣品跑至分離膠再將電泳電壓調(diào)高至120 V,待樣品遷移到目的位置后,結(jié)束電泳。濕法轉(zhuǎn)膜后,加入含5% 脫脂奶粉的TBS-T 液體中室溫封閉1 h。按1∶1 000的比例加入一抗稀釋液,室溫孵育3 h,4 ℃過夜。第2 天,孵育二抗、洗膜、顯影。

3 結(jié)果

3.1 32 個(gè)鵝不食草單體化合物對(duì)肺癌細(xì)胞系的抑制作用 用濃度為20 μmol/L 的32 種鵝不食草單體化合物(CM-1～CM-32) 分別處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H460、A549,48 h 后行MTT 實(shí)驗(yàn)分析其對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。在32 種鵝不食草單體中有10 種(31.3%) 能使這2 種細(xì)胞株的增殖活性減少15%以上,它們分別是CM-5、CM-6、CM-8、CM-13、CM-16、CM-19 (阿里二醇)、CM-20、CM-25 (6-氧-當(dāng)歸酰多梗白菜菊素)、CM-26 (異戊酸心菊內(nèi)酯)、CM-28 (圖1、表1)。

圖1 32 種鵝不食草單體成分對(duì)肺癌細(xì)胞增殖活性的影響（，n=3）Fig.1 Effects of thirty-two compounds on lung cancer cell viability （，n=3）

3.2 抗肺癌活性較強(qiáng)的化合物 3 個(gè)化合物阿里二醇、6-氧-當(dāng)歸酰多梗白菜菊素、異戊酸心菊內(nèi)酯在20 μmol/L 的濃度下對(duì)A549、H460 細(xì)胞系具有顯著的抑制作用,對(duì)細(xì)胞增殖活性的抑制率達(dá)到70%以上(圖1)。于是進(jìn)一步研究了這3 個(gè)化合物的抗肺癌作用。在不同濃度梯度下,這3 個(gè)化合物對(duì) 5 種肺癌 細(xì)胞株 H460、A549、H1975、H1299、H520 的增殖均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用,且呈劑量依賴性,IC50均為μmol/L 級(jí),而6-氧-當(dāng)歸酰多梗白菜菊素、異戊酸心菊內(nèi)酯的作用較強(qiáng),對(duì)H460、A549、H1975、H1299 細(xì)胞株的IC50在2.74～8.59 μmol/L 之間,而對(duì)H520 的IC50分別為11.68、20.66 μmol/L (表2)。

3.3 異戊酸心菊內(nèi)酯對(duì)H1975、H1299 細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用 由于異戊酸心菊內(nèi)酯具有較強(qiáng)的抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用(表2),于是進(jìn)一步研究其凋亡誘導(dǎo)作用。用濃度為5、7.5 μmol/L 的異戊酸心菊內(nèi)酯處理H1975 細(xì)胞48 h,可使60%和80%的細(xì)胞發(fā)生凋亡 (圖2)。用濃度為2.5、5、7.5 μmol/L的異戊酸心菊內(nèi)酯同樣處理H1299 細(xì)胞,發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例分別為15%、66.5%、84% (圖3)。

3.4 異戊酸心菊內(nèi)酯對(duì)凋亡蛋白的影響 半胱氨酸蛋白酶 (cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase) 家族是細(xì)胞凋亡的“執(zhí)行者”,Caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮主要作用,其活化后對(duì)底物PARP (poly ADP-ribose polymerase) 的剪切被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要依據(jù)。caspase-8 在外源凋亡途徑中發(fā)揮重要作用。結(jié)果顯示,加藥24 h 后,異戊酸心菊內(nèi)酯引起了H1975、H1299 細(xì)胞中PARP 的剪切并產(chǎn)生降解片段,同時(shí)caspase-3、caspase-8 也出現(xiàn)剪切活化片段(圖4),說明異戊酸心菊內(nèi)酯可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

表1 從鵝不食草中分離的10 個(gè)單體化合物Tab.1 Ten compounds isolated from C.minima

表2 阿里二醇、6-O-當(dāng)歸酰多梗白菜菊素、異戊酸心菊內(nèi)酯對(duì)不同肺癌細(xì)胞系的IC50值（μmol/L，，n=3）Tab.2 The IC50 values of arnidiol，6-O-angeloylplenolin，and helenalin-isovalerate for non-small cell lung cancer cell lines（μmol/L，，n=3）

表2 阿里二醇、6-O-當(dāng)歸酰多梗白菜菊素、異戊酸心菊內(nèi)酯對(duì)不同肺癌細(xì)胞系的IC50值（μmol/L，，n=3）Tab.2 The IC50 values of arnidiol，6-O-angeloylplenolin，and helenalin-isovalerate for non-small cell lung cancer cell lines（μmol/L，，n=3）

3.5 異戊酸心菊內(nèi)酯對(duì)H1975 細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白p-ERK、p-AKT 及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的影響 眾多研究表明,p-ERK (phospho-extracellular regulated protein kinases,細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶)、p-AKT(phospho-protein kinase B,蛋白激酶B) 在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá),并且它的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)。NF-κB (nuclear factor kappa-B) 是一種核轉(zhuǎn)錄因子,存在廣泛,作為許多重要細(xì)胞的中央調(diào)節(jié)劑,在功能上,NF-κB 能調(diào)控大量先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)過程,在細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥及腫瘤的發(fā)生中扮演了重要角色。本研究發(fā)現(xiàn)(圖5),加藥24 h 后,異戊酸心菊內(nèi)酯使H1975 細(xì)胞中p-ERK、p-AKT 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05,P＜0.01),且呈濃度依賴性,而H1975 細(xì)胞中ERK、AKT 蛋白的本底表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化。同樣加藥24 h 后,可見NF-κB 蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比降低。說明異戊酸心菊內(nèi)酯發(fā)揮抗腫瘤的作用可能與抑制p-ERK、p-AKT 及NF-κB 的表達(dá)有關(guān)。

圖3 異戊酸心菊內(nèi)酯對(duì)H1299 細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用（，n=3）Fig.3 Helenalin-isovalerate induced H1299 cells apoptosis （，n=3）

圖4 異戊酸心菊內(nèi)酯對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響（，n=3）Fig.4 Effect of helenalin-isovalerate on the apoptosis-related proteins

圖5 異戊酸心菊內(nèi)酯對(duì)H1975 細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的影響（，n=3）Fig.5 Effect of helenalin-isovalerate on the proliferation-related proteins in H1975 cells （，n=3）

4 討論

肺癌已成為全世界發(fā)病率最高、致死人數(shù)最多的惡性腫瘤,全球每年相關(guān)死亡人數(shù)達(dá)180 萬[10],在我國(guó)就有63.1 萬[11]。目前,肺癌的西醫(yī)治療手段主要包括手術(shù)、放化療、靶向治療、免疫治療等,取得一定效果,但非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌的5 年生存率分別只有19%、6%[12],故研發(fā)有效的相關(guān)新型藥物是醫(yī)學(xué)界重要研究課題。我國(guó)擁有豐富的中藥資源,對(duì)其應(yīng)用和研究有著悠久的歷史,開發(fā)抗肺癌相關(guān)藥物具有重要的臨床意義。

鵝不食草主要化學(xué)成分包括黃酮、萜類、揮發(fā)油、酚類、酚酸等[13-16]。本實(shí)驗(yàn)所篩選出的3 種活性較好的化合物中,CM-19 為阿里二醇,關(guān)于其抗癌活性的研究很少,值得將來深入研究其作用及機(jī)理；CM-25 為6-氧-當(dāng)歸酰多梗白菜菊素,是第1種Skp1 抑制劑,對(duì)STAT3 也有一定抑制作用,可導(dǎo)致癌蛋白NIPA、Skp2、β-TRCP 發(fā)生降解而對(duì)抑癌蛋白F 框/WD40 域蛋白基因(F-box and WD-40 domain-containing protein 7,FBXW7) 無作用,并在細(xì)胞與動(dòng)物模型顯示較強(qiáng)的抗癌作用,包括抗非小細(xì)胞肺癌[7-8]、多發(fā)性骨髓瘤等[17]；CM-26 為異戊酸心菊內(nèi)酯,它是倍半萜類化合物,對(duì)其活性的研究極少,但發(fā)現(xiàn)心菊內(nèi)酯可抑制NF-κB 表達(dá),繼而引起細(xì)胞自噬性死亡[18],或通過抑制NF-κB、促進(jìn)反應(yīng)性氧類產(chǎn)生而逆轉(zhuǎn)B 細(xì)胞淋巴瘤-2 (Bcell lymphoma 2,Bcl-2) 介導(dǎo)的凋亡抵抗[19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),異戊酸心菊內(nèi)酯可抑制肺癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)caspase-3 依賴性的細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與抑制了p-ERK、p-AKT、NF-κB 蛋白表達(dá)有關(guān),表明鵝不食草含有多種抗癌物質(zhì),單體化合物的活性及其機(jī)理并不相同,它們聯(lián)合作用才能呈現(xiàn)總體抗癌活性。

鵝不食草作為一種傳統(tǒng)中藥,雖為2020 年版《中國(guó)藥典》 收錄,但其抗癌活性在臨床上未被檢測(cè)過。因此,結(jié)合前期研究結(jié)果[7-8,17-19],本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為有必要開展鵝不食草用于肺癌等惡性腫瘤治療的臨床試驗(yàn),可單獨(dú)使用,也可與其他藥物聯(lián)用,以明確該藥材是否具有抗癌的臨床用途,并為相關(guān)治療提供新選擇。