林海霞,代俊萍

(1.樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,四川 樂(lè)山 614000;2.樂(lè)山市中醫(yī)醫(yī)院,四川 樂(lè)山 614000)

風(fēng)寒感冒顆粒是由葛根、防風(fēng)、甘草、陳皮等11 味藥材制成的中成藥,具有解表發(fā)汗、疏風(fēng)散寒的功效,用于治療風(fēng)寒感冒、發(fā)熱、頭痛、惡寒、無(wú)汗[1],該制劑收載于衛(wèi)生部頒布標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第1 冊(cè)(WS3-B-0045-89),但其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚無(wú)定量測(cè)定方法,而且文獻(xiàn)[2-8]也僅涉及其中1～2 種成分。中藥制劑成分復(fù)雜,采用多成分分析以全面評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量已成為一種趨勢(shì)[9-11]。

研究表明,葛根素具有抗炎、抗氧化等作用[12],升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌等作用[13],甘草苷、甘草酸銨具有抗氧化、抗炎等作用[14-15],橙皮苷具有抗炎、抗過(guò)敏、抗氧化、抗自由基等作用[16]。因此,本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定風(fēng)寒感冒顆粒中葛根所含葛根素,防風(fēng)所含升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷,甘草所含甘草苷、甘草酸銨,陳皮所含橙皮苷的含有量,以期更好地控制該制劑質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 型HPLC 色譜儀(美國(guó)Agilent 公司)；CQ-100B 型超聲波清洗器(250 W、50 kHz,上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠)；XS205DU 型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司]；ULUP-11-10 超純水機(jī)(成都超純水科技有限公司)。

1.2 試劑與藥物 6 批風(fēng)寒感冒顆粒(8 g/袋)購(gòu)于云南白藥集團(tuán)股份有限公司(批號(hào)ZLA1812、ZHA1906)、貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥股份有限公司(批號(hào)A20181221、A20190634)、修正吉林長(zhǎng)白山藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司(批號(hào)181134、181005)。葛根素(批號(hào)110752-201816,純度95.4%)、升麻素苷(批號(hào)111522-201209,純度93.7%)、甘草苷(批號(hào)111610-201607,純度93.1%)、橙皮苷(批號(hào)110721-201617,純度96.1%)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號(hào)111523-201509,純度95.8%)、甘草酸銨對(duì)照品 (批號(hào)110731-201619,純度93.0%) 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 JADE-PAK ODS-AQ C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相甲醇(A) -0.1%磷酸(B),梯度洗脫(0～20 min,25%～35% A；20～27 min,35% A；27～45 min,35%～50% A；45～70 min,50%～95% A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm (甘草酸銨)、250 nm (葛根素)、254 nm (升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷)、276 nm (甘草苷)、283 nm (橙皮苷)；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取各對(duì)照品適量,分別加甲醇制成含葛根素1.803 0 mg/mL、升麻素苷0.417 9 mg/mL、甘草苷0.192 7 mg/mL、橙皮苷0.304 8 mg/mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷0.423 4 mg/mL、甘草酸銨0.112 7 mg/mL 的貯備液,分別精 密吸取0.8、0.5、0.3、2.0、1.0、3.0 mL,置于同一10 mL 量瓶中,甲醇定容,搖勻,即得(各成分質(zhì)量濃度分別為144.2、20.89、5.781、60.96、42.34、33.81 μg/mL)。

2.3 供試品溶液制備 取顆粒適量,研細(xì),取細(xì)粉約3 g,精密稱(chēng)定,置于具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇50 mL,稱(chēng)定質(zhì)量,超聲處理30 min,放冷,70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.4 陰性樣品溶液 按顆粒處方比例和制備工藝,分別制備缺葛根、缺防風(fēng)、缺甘草、缺陳皮的陰性樣品,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備,即得。

2.5 系統(tǒng)適用性與專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知,各成分均達(dá)到基線分離,分離度均大于1.5,陰性無(wú)干擾,表明該方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC charomatograms of various constituents

2.6 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2” 項(xiàng)下貯備液,70%甲醇稀釋成5 個(gè)質(zhì)量濃度,各精密吸取10 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸,結(jié)果見(jiàn)表1,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次,測(cè)得葛根素、升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨峰面積RSD 分別為 0.05%、0.45%、0.75%、0.38%、0.56%、0.36%,表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份“2.3” 項(xiàng)下供試品溶液,室溫下分別于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得葛根素、升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨峰面積RSD 分別為0.24%、0.96%、0.89%、0.34%、0.48%、0.55%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批顆粒(批號(hào)ZLA1812)6 份,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得葛根素、升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨含有量RSD 分別為0.78%、1.01%、1.35%、0.45%、1.08%、1.05%,表明該方法重復(fù)性良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取各成分含有量已知的同一批顆粒(批號(hào)ZLA1812) 1.5 g,共6 份,加入1.803 0 mg/mL 葛根素對(duì)照品溶液1.7 mL、0.417 9 mg/mL 升麻素苷對(duì)照品溶液0.4 mL、0.192 7 mg/mL 甘草苷對(duì)照品溶液0.8 mL、0.304 8 mg/mL 橙皮苷對(duì)照品溶液 3.8 mL、0.423 4 mg/mL 5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品溶液2.0 mL、0.112 7 mg/mL 甘草酸銨對(duì)照品溶液10.0 mL,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果,葛根素、升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨平均加樣回收率分別為100.45%、94.36%、92.25%、99.74%、93.25%、93.05%,RSD 分別為 1.02%、1.14%、1.74%、1.26%、1.35%、1.41%。

2.11 樣品含有量測(cè)定 取6 批顆粒,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,外標(biāo)法計(jì)算含有量,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg/g，n=3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取方式(超聲、回流),提取溶劑(甲醇、70% 甲醇、70% 乙醇、無(wú)水乙醇)、提取時(shí)間(15、30、60 min),發(fā)現(xiàn)70% 甲醇超聲提取30 min 時(shí)出峰率、峰面積最理想,而且無(wú)雜質(zhì)干擾。再采用二極管陣列檢測(cè)器,在200～400 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外吸收掃描,為了保證各成分均有適宜的靈敏度、分離度、豐度并無(wú)干擾,最終選擇波長(zhǎng)切換模式。結(jié)果顯示,不同廠家、批次風(fēng)寒感冒顆粒中6 種成分含有量均存在一定差異,可能與制劑生產(chǎn)工藝及投料有關(guān),故廠家不僅要按標(biāo)準(zhǔn)工藝操作,還應(yīng)嚴(yán)格控制原料藥質(zhì)量,這樣才能保證成藥質(zhì)量穩(wěn)定、安全有效。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定風(fēng)寒感冒顆粒中葛根素、升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨的含有量,該方法操作簡(jiǎn)便,準(zhǔn)確性、重復(fù)性良好,可用于該制劑的質(zhì)量控制。