鄭巍亮 余江清▲ 杜 芬 謝寶剛 賀祥源

1.江西省景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江西景德鎮(zhèn) 333000；2.南昌大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌 330006；3.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，江西南昌 330006

肺癌是一種非特異性疾病，很難與其他肺部疾病區(qū)分開來，采取安全、有效的早期診斷方法，可使患者平均生存期從5年以上的15%增加到85%[1-2]。目前發(fā)現(xiàn)，低劑量螺旋CT 對早期肺癌的檢出率較低，其假陽性結(jié)果可能會導(dǎo)致過度診斷[3-4]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的全面發(fā)展，許多新的腫瘤標(biāo)志物對惡性腫瘤的早期診斷及篩查具有重要臨床價值，而目前常規(guī)腫瘤標(biāo)志物對肺癌早期診斷缺乏敏感度與特異性。代謝組學(xué)是一種新興的組學(xué)技術(shù)，研究對象主要為小分子的代謝物（1000 kb 以下），從代謝物水平反應(yīng)機(jī)體發(fā)生的一系列微小變化，適合于疾病的診斷研究[5]。代謝組學(xué)技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用于肺癌的研究，已有眾多學(xué)者利用多種檢測技術(shù)對肺癌的診斷、治療預(yù)測展開了相關(guān)研究，并獲得優(yōu)異的研究成果[6-10]。本研究通過核磁共振氫譜（1HNMR）非靶標(biāo)技術(shù)對肺癌組織和正常肺組織相關(guān)的差異代謝物進(jìn)行分析，再次通過利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）靶標(biāo)技術(shù)檢測肺癌患者、健康人群血清中相關(guān)代謝物進(jìn)行定量分析，篩選對肺癌診斷較好的代謝物組，為肺癌早期診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年7月～2018年12月47例術(shù)后肺癌組織及正常肺組織標(biāo)本，30例腺癌患者中男22例，女8例；年齡44～73歲，平均（58.5±11.5）歲；17例鱗癌患者中男15例，女2例；年齡46～72歲，平均（60.3±8.5）歲；基于國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第八版肺癌TNM分期，Ⅰ期18例，Ⅱ期22例，ⅢA 期7例；有吸煙史者35例。收集143例經(jīng)病理確診的肺癌患者（肺癌組）血清及99例健康體檢者（正常對照組）的血清標(biāo)本。肺癌組男102例，女41例；年齡39～86歲，平均（62.5±15.2）歲；腺癌69例，鱗癌52例，小細(xì)胞癌22例；TNM分期Ⅰ期25例，Ⅱ期42例，Ⅲ期52例，Ⅳ期24例；有吸煙史者105例。肺癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①血液標(biāo)本為早晨9 時采集的；②無糖尿病及其他代謝疾病和長期服藥史；③入選前未接受任何抗腫瘤治療且不合并其他腫瘤，功能狀態(tài)評分（PS）＜2分。標(biāo)本均來自南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科及景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，收集后于-80℃冷凍保存。本研究得到這兩所醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并取得患者的知情同意書。

1.2 肺癌組織標(biāo)本處理

冷凍保存的肺癌組織及正常組織取出后室溫解凍，吸除標(biāo)本表面多余的水分，精密稱取0.1 g 組織置于勻漿器，3 ml 的勻漿液（80%甲醇）分3次加入勻漿器中，提取的勻漿液匯總于5 ml 的EP 管中，1000 r/min離心10 min后取1 ml 上清液于EP 管中，EP 管置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中烘干。烘干物用蒸餾水460 μl 復(fù)溶，取上清液445 μl 與磷酸緩沖液50 μl、三甲基甲硅烷基丙酸鈉鹽溶液（重水）50 μl 混勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液500 μl 于核磁管中，行1HNMR 檢測。

1.3 肺癌血清標(biāo)本處理

將收集的所有血清標(biāo)本于-80℃冰箱中取出，室溫解凍。取血清樣品50 μl 與30 μl 同位素標(biāo)記的膽堿溶液（乙酸銨溶液）、30 μl 的80%乙腈和340 μl乙腈均勻混合，后于12 000 r/min 離心5 min，取上清200 μl 進(jìn)行膽堿類物質(zhì)的檢測。取30 μl 血清樣品與30 μl 內(nèi)標(biāo)溶液、30 μl 乙酸銨溶液、30 μl 的80%乙腈、和330 μl 乙腈均勻混合以沉淀蛋白，同理，超聲和離心后取上清進(jìn)行嘌呤類物質(zhì)的檢測。

1.4 標(biāo)本中代謝物測定

1.4.1 膽堿類標(biāo)準(zhǔn)品的配置 甜菜堿、胱硫醚、二甲基甘氨酸、乙酰肉堿、乙酰膽堿、肉堿、肌酐、膽堿和S-腺苷甲硫氨酸等物質(zhì)分別用水溶解配成母液。取100 μl各母液混勻，依次進(jìn)行二倍稀釋。取50 μl 各濃度的稀釋液與30 μl 乙酸銨溶液配制的內(nèi)標(biāo)溶液、30 μl 80%乙腈溶液和340 μl 乙腈進(jìn)行沉淀蛋白、超聲和離心后進(jìn)樣。

1.4.2 嘌呤類標(biāo)準(zhǔn)品的配置 尿苷、黃嘌呤、鳥苷、肌苷、腺苷、鳥嘌呤、尿酸、黃嘌呤核苷、次黃嘌呤和腺嘌呤分別用2 ml 的NaOH 溶液（0.1 mol/L）溶解，甲醇稀釋成一定濃度的母液。各母液吸取適量均勻混合，使各物質(zhì)的濃度為20.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0.5 μg/ml，后續(xù)濃度依次2倍稀釋。取30 μl 不同濃度梯度的稀釋液與30 μl 乙酸銨溶液、30 μl 內(nèi)標(biāo)溶液、30 μl 牛血清白蛋白溶液和330 μl 乙腈進(jìn)行膽堿樣標(biāo)準(zhǔn)品操作。

1.4.3 靶標(biāo)代謝組學(xué)的檢測方法 采用多重反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），正離子檢測；電噴霧毛細(xì)管電壓設(shè)定為3.0 kV，干燥氣（氮?dú)猓┝魉贋?0 L/h；離子源溫度為100℃，色譜柱溫度為40℃，自動進(jìn)樣器溫度為20℃；采用ACOQUITY UPLC BEH HILIC 色譜柱（2.1 mm×100 mm，7 μm；Waters，USA）；10 mmol/L 0.01%乙 酸銨（A）-乙腈（B）作為流動相，流速為0.3 ml/min。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

1HNMR 的數(shù)據(jù)利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫、統(tǒng)計全相關(guān)譜（STCOSY）、2 維全相關(guān)譜（TCOSY）及標(biāo)準(zhǔn)品比對等方法進(jìn)行代謝物鑒定，主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計分析，變量重要性（VIP）值聯(lián)合P 值得到差異代謝物。UPLC-MS/MS 的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，采用受試者工作特征（ROC）曲線評價各代謝物的診斷性能，獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)篩選差異代謝物，差異代謝物建立Logistic回歸模型，確定診斷價值高的代謝物組合。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織與正常肺組織的PCA與PLS-DA分析

肺癌組織和正常肺組織的1HNMR 數(shù)據(jù)PCA 得分見圖1A（封三），肺癌組織與正常肺組織兩個群組之間的代謝物比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。肺癌組織與正常肺組織的PLS-DA 模型（R2X=0.424，R2Y=0.834，Q2=0.778）的得分見圖1B（封三），兩組區(qū)分結(jié)果幾乎不存在重疊情況，二者可以有效分開。進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)來檢驗(yàn)所建的模型，置換檢驗(yàn)后的R2截距為0.218，Q2截距為-0.0622，本模型有效（圖1C，封三）。

圖1 肺癌及正常肺組織的PCA、PLS-DA 及200次置換驗(yàn)證分析結(jié)果

2.2 篩選肺癌組織與正常肺組織間的差異代謝物

對明確鑒定的且VIP 值＞1 的13種代謝物積分，脂質(zhì)、乳酸和甜菜堿為肺癌組織與正常肺組織相關(guān)的差異代謝物（P＜0.05）。肺癌組織中脂質(zhì)、亮氨酸、纈氨酸、3-羥基丁酸、琥珀酸、膽堿、葡萄糖、甜菜堿、甘氨酸、乳酸和甲酸的含量高于正常肺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；醋酸的含量低于正常肺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 基于1HNMR 數(shù)據(jù)進(jìn)行肺癌和正常肺組織分類的代謝物信息（ng/ml，±s）

表1 基于1HNMR 數(shù)據(jù)進(jìn)行肺癌和正常肺組織分類的代謝物信息（ng/ml，±s）

代謝物 肺癌組織（n=47）正常肺組織（n=47） VIP 值 P 值脂質(zhì)亮氨酸纈氨酸3-羥基丁酸丙氨酸醋酸琥珀酸膽堿葡萄糖甜菜堿甘氨酸乳酸甲酸6.94±0.59 48.98±2.51 25.58±1.89 46.36±4.59 113.69±3.92 109.89±6.77 31.66±2.17 22.01±1.22 527.75±33.41 207.58±8.71 35.42±2.45 146.84±8.33 14.37±0.94 1.69±0.08 39.39±1.85 19.01±2.11 18.92±1.04 123.01±4.93 195.00±5.31 16.96±0.63 16.16±0.98 276.25±7.69 123.81±2.39 26.56±1.57 74.99±5.11 4.55±0.24 1.24 1.62 2.37 3.15 3.23 3.94 1.02 1.73 2.81 1.48 1.56 3.11 1.84 0.000 0.002 0.026 0.000 0.143 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.002 0.000 0.000

2.3 肺癌和健康組膽堿和嘌呤類代謝物定量分析

基于1HNMR 非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)有利于診斷的差異代謝物與膽堿及嘌呤代謝通路密切相關(guān)，兩者通路上的物質(zhì)均參與一碳代謝和甲基化。肺癌組血清中黃嘌呤、黃嘌呤核苷、鳥苷、次黃嘌呤和乙酰膽堿的含量高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而血清中尿苷、腺嘌呤、腺苷、鳥嘌呤、尿酸、肌苷、膽堿、甜菜堿、肉堿、肌酐、二甲基甘氨酸、乙酰肉堿和胱硫醚含量低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中黃嘌呤核苷、尿苷、鳥苷、腺嘌呤、腺苷、鳥嘌呤、尿酸、肌苷、膽堿、肉堿、肌酐、二甲基甘氨酸、乙酰肉堿、胱硫醚的組間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），甜菜堿與黃嘌呤的組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 UPLC-MS/MS 定量檢測血清代謝物水平

2.4 差異代謝物對肺癌患者和健康人群的鑒別診斷效能分析

黃嘌呤核苷、鳥苷、尿酸、肌苷和胱硫醚對肺癌有較好的診斷價值（AUC＞0.8）（表3）。

表3 量化代謝指標(biāo)的ROC 分析結(jié)果

2.5 肺癌患者和健康組鑒別診斷的Logistic回歸分析

將找出的差異代謝物進(jìn)行二元向前Wald 的Logistic回歸分析，胱硫醚、鳥苷、尿酸和腺嘌呤聯(lián)合的標(biāo)志物組合會提高診斷性能，建立的模型方程為Y=10.774+3.891×X1+0.527×X2-0.001×X3-0.028×X4（X1：鳥苷的濃度；X2：腺嘌呤的濃度；X3：尿酸的濃度；X4：胱硫醚的濃度），AUC 為0.993，分類準(zhǔn)確度為93.0%，敏感度和特異性分別是92.4%和100.0%，ROC曲線見圖2。

圖2 組合變量進(jìn)行肺癌診斷的ROC曲線

3 討論

早期篩查已成為肺癌防治的關(guān)鍵，目前臨床應(yīng)用的癌胚抗原、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、鱗狀細(xì)胞抗原及細(xì)胞角蛋白19 片斷抗原對肺癌早期診斷價值有限，探索診斷肺癌特異性強(qiáng)、敏感性高的生物標(biāo)志物成為臨床研究的熱點(diǎn)。

本研究利用1HNMR 非靶標(biāo)代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)果顯示：肺癌組織中脂質(zhì)、亮氨酸、纈氨酸、3-羥基丁酸、琥珀酸、膽堿、葡萄糖、甜菜堿、甘氨酸、乳酸和甲酸的含量高于正常肺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；醋酸的含量低于正常肺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與前人研究結(jié)果一致[11]。肺癌組織中乳酸、3-羥基丁酸水平的上升，可能與癌癥本身能量代謝密切相關(guān)，腫瘤組織出現(xiàn)有氧呼吸減慢，無氧酵解增強(qiáng)有關(guān)[12-13]。

由于血液是容易獲取的生物標(biāo)本，本研究對肺癌患者血液中代謝物進(jìn)行研究，考察肺癌組織代謝產(chǎn)物與血液中代謝物變化相關(guān)性，對肺癌的診斷具有重要意義。腫瘤組織作為肺癌直接病變部位，其代謝產(chǎn)物能更好展現(xiàn)癌癥的狀態(tài)。首先以肺癌組織為研究標(biāo)本，利用非靶標(biāo)代謝組學(xué)方法對其代謝物測定，然后再用靶標(biāo)代謝組學(xué)方法對血清中代謝物進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：肺癌組血清中黃嘌呤、黃嘌呤核苷、鳥苷、次黃嘌呤和乙酰膽堿的含量高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而血清中尿苷、腺嘌呤、腺苷、鳥嘌呤、尿酸、肌苷、膽堿、甜菜堿、肉堿、肌酐、二甲基甘氨酸、乙酰肉堿和胱硫醚含量低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。肺癌患者血清乙酰膽堿含量升高，可能與膽堿乙?；傅幕钚栽黾踊蚰憠A酯酶的活性下降有關(guān)[14]。肺癌患者較正常對照組血清次黃嘌呤、鳥苷含量明顯升高，然而鳥嘌呤、肌苷含量顯著下降，或許是因?yàn)猷堰屎塑樟姿峄傅幕钚栽黾?，也可能是因?yàn)轼B嘌呤脫氨酶及次黃嘌呤核苷酸脫氫酶活性增加，促進(jìn)其合成[15-16]。

另外發(fā)現(xiàn)，肺癌患者的血清胱硫醚含量降低，這可能與分解胱硫醚的胱硫醚-β-裂解酶活性升高或胱硫醚-β-合酶的活性降低密切相關(guān)。然而肺癌患者血清尿酸的含量下降可能是由于排泄出現(xiàn)障礙、重吸收的尿酸減少，一定水平的尿酸可以抗氧化、清除自由基、增強(qiáng)免疫、降低患癌的風(fēng)險[17-19]。血清中的甜菜堿與膽堿含量降低可能與合成減少明顯有關(guān)[20]。

通過非靶標(biāo)UPLC-MS/MS 定量結(jié)果顯示的兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)作為因變量，經(jīng)二元Logistic回歸分析，聯(lián)合測定血清代謝物胱硫醚、鳥苷、尿酸和腺嘌呤為最佳生物標(biāo)志物組合，AUC 為0.993，敏感度和特異度均大于85%。為肺癌的早期診斷提供參考。

然而，本研究也存在以下缺陷：①臨床研究樣本量偏?。虎诖x組學(xué)結(jié)果沒有與肺癌患者驅(qū)動基因及免疫狀態(tài)進(jìn)行相關(guān)研究。鑒于此，本研究后期加大肺癌臨床樣品量，增加代謝物篩選量，以找到更好的代謝物，為肺癌早期診斷提供新的方法。并將繼續(xù)探討肺癌代謝組學(xué)與基因組學(xué)-轉(zhuǎn)錄組學(xué)-蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)性，為肺癌精準(zhǔn)治療提供新的方向。