姜莉莉，王開(kāi)運(yùn)，武玉國(guó)，王開(kāi)元，王紅艷

(1.山東省果樹(shù)研究所，山東 泰安 271000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山東 泰安 271018；3.山東慧泰華生物技術(shù)有限公司,山東 泰安 271000)

在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，因長(zhǎng)期大量施用化學(xué)肥料和連作種植，出現(xiàn)了土壤退化、連作障礙嚴(yán)重、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降、生態(tài)環(huán)境惡化等一系列問(wèn)題，對(duì)食品及環(huán)境安全造成嚴(yán)重威脅。在此背景下，生物肥料因環(huán)境友好、資源節(jié)約、綠色安全等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注，在無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中的地位不斷提高[1]。有研究報(bào)道，生物肥具有速效、長(zhǎng)效和改良土壤的作用。同時(shí)，生物肥中所含的功能微生物還可將作物難以吸收的固定態(tài)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為易吸收的形態(tài)，提高養(yǎng)分供應(yīng)速率[2]。近年來(lái)，我國(guó)生物肥料研究和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展迅速，產(chǎn)業(yè)鏈基本形成，系統(tǒng)評(píng)價(jià)生物肥料在耕地質(zhì)量提升及農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改善中的作用，對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和綠色農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)意義重大。

豐田寶生物有機(jī)肥(含高效固氮菌生物有機(jī)肥)是國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃中土壤改良項(xiàng)目的發(fā)明成果，由高效固氮菌、解磷菌、解鉀菌和拮抗菌組成功能菌群，與活化腐殖酸、磷礦粉、鉀礦粉等有機(jī)載體混合造粒而成。該生物有機(jī)肥在番茄、黃瓜、草莓、葡萄等作物上一次性施用，可完全替代化學(xué)肥料，同時(shí)還可改善農(nóng)產(chǎn)品外觀和口感[3]。然而，該生物肥對(duì)作物果實(shí)品質(zhì)的改善效果和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的調(diào)控機(jī)理尚不清楚。本研究以連續(xù)4 a 8次施用該生物有機(jī)肥的設(shè)施番茄及種植土壤為研究對(duì)象，分析其與常規(guī)施肥處理的土壤養(yǎng)分和微生物群落差異，探求該肥料提升農(nóng)田地力的效果及機(jī)理；同時(shí)比較不同施肥方式對(duì)番茄綜合品質(zhì)的影響，為連作土壤的生態(tài)改良、生態(tài)農(nóng)業(yè)的持續(xù)發(fā)展和農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的提升提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 供試肥料

豐田寶生物有機(jī)肥(含高效固氮菌生物有機(jī)肥)，含高效固氮菌、解磷菌、解鉀菌和拮抗菌組成功能菌群，與活化腐殖酸、磷礦粉、鉀礦粉等混合造粒而成，含活菌數(shù)≥0.2億/g，有機(jī)質(zhì)含量≥40%，氮、磷、鉀總含量≤4.0%，由山東友邦肥業(yè)科技有限公司生產(chǎn)。對(duì)照肥料由農(nóng)戶(hù)在當(dāng)?shù)剞r(nóng)資店購(gòu)置。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共設(shè)2個(gè)處理，處理1：連續(xù)施用豐田寶生物有機(jī)肥4 a，每年種植2茬番茄，按500 g/株的劑量穴施后移栽番茄幼苗并覆土，澆透水，番茄整個(gè)生長(zhǎng)期不再追施任何其他肥料；處理2：常規(guī)施肥處理，每年施用腐熟雞糞60 m3/hm2和復(fù)合肥(15-15-15)1 500 kg/hm2，淺翻入土，起壟后移栽番茄幼苗并澆水，待番茄第1批果實(shí)采收后追施沖施肥(15-15-15)150 kg/hm2，之后每隔10～15 d沖施1次，至果實(shí)采收結(jié)束每一生長(zhǎng)季節(jié)共沖施8次。每個(gè)小區(qū)面積20 m2、定植80株為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理重復(fù)3次，隨機(jī)分布，處理間設(shè)有1.5 m寬的緩沖帶。

1.3 試驗(yàn)操作

試驗(yàn)區(qū)設(shè)在山東省泰安市岱岳區(qū)房村鎮(zhèn)西良甫村(N35°57′56.14″, E117°11′23.62″)的設(shè)施番茄田，為番茄種植基地核心區(qū)，農(nóng)戶(hù)已連續(xù)種植番茄10余年，管理經(jīng)驗(yàn)豐富。試驗(yàn)設(shè)施為黃淮流域常見(jiàn)的簡(jiǎn)易土墻日光溫室，由于連年施用化學(xué)肥料，土壤鹽漬化程度較高。每年8月中下旬定植第1茬三葉期番茄幼苗，坐果6層后打頂，次年1月上旬套種第2茬，2月拔第1茬秧，7月拔第2茬秧。2014年8月15日種植第1茬番茄，2018年6月21日末茬拔秧。每茬幼苗移栽前施用2%的吡蟲(chóng)啉顆粒劑預(yù)防煙粉虱危害，移栽后30 d內(nèi)噴施噻蟲(chóng)嗪1次防治煙粉虱，番茄坐果期噴施50%烯酰嗎啉·錳鋅可濕性粉劑3次，間隔20～30 d，預(yù)防番茄晚疫病等病害，日常管理按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)進(jìn)行。

1.4 樣品采集與測(cè)定

2018年4月16日，采集末茬第1批番茄成熟果實(shí)進(jìn)行品質(zhì)測(cè)定。每個(gè)小區(qū)隨機(jī)挑選9個(gè)可商品化果實(shí)測(cè)量單果質(zhì)量和果實(shí)的橫、縱徑，并計(jì)算果型指數(shù)。果實(shí)勻漿后，減壓干燥測(cè)定果實(shí)含水量。以NaOH滴定法測(cè)定可滴定酸含量。以蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量[4]，鉬藍(lán)比色法測(cè)定Vc含量[5]，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)法測(cè)定番茄紅素含量[6]。2018年6月5日(末茬拔秧前期)，每個(gè)處理選取20個(gè)點(diǎn)，采集5～15 cm土層土壤樣品，充分混勻、過(guò)篩后分成2份，一份以干冰保存并送樣，用于土壤微生物的高通量測(cè)定；另一份完全風(fēng)干，采用常規(guī)分析法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀含量[7]。

微生物群落多樣性分析由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

抽提基因組DNA，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以帶有Barcode的515F/907R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并進(jìn)行凝膠回收。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)定量后，按照測(cè)序量要求進(jìn)行相應(yīng)比例混合后構(gòu)建Miseq文庫(kù)并測(cè)序。

Miseq測(cè)序得到的PE reads經(jīng)過(guò)拼接、質(zhì)控和過(guò)濾后進(jìn)行OTU聚類(lèi)分析和物種分類(lèi)學(xué)分析，基于OTU進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，對(duì)測(cè)序深度的檢測(cè)；基于分類(lèi)學(xué)信息，在各個(gè)分類(lèi)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2016和SPSS 18.0等軟件進(jìn)行，差異顯著性采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 連續(xù)4 a施用含高效固氮菌生物有機(jī)肥對(duì)番茄果實(shí)品質(zhì)的影響

由表1可知，連續(xù)4 a施用該生物有機(jī)肥的番茄果實(shí)單果質(zhì)量、果型指數(shù)、含水量與常規(guī)施肥處理差異不顯著；番茄果實(shí)糖酸比4.39，較常規(guī)施肥對(duì)照3.95提高了11.1%；Vc含量108.2 μg/g，較常規(guī)施肥處理100.9 μg/g提高了7.2%；番茄紅素含量49.9 μg/g，較常規(guī)施肥對(duì)照44.4 μg/g提高了12.4%。由此可見(jiàn)，連續(xù)施用該生物有機(jī)肥，可顯著提高番茄果實(shí)的糖酸比、Vc和番茄紅素含量。同時(shí)，連續(xù)施用生物有機(jī)肥種植的番茄果實(shí)果肉為沙性，質(zhì)地緊實(shí)，口感好，表觀光亮，商品質(zhì)量大幅度提高。

表1 連續(xù)4 a施用含高效固氮菌生物有機(jī)肥對(duì)番茄果實(shí)品質(zhì)的影響

2.2 連續(xù)4 a施用含高效固氮菌生物有機(jī)肥對(duì)土壤養(yǎng)分含量的影響

由表2可知，連續(xù)施用生物有機(jī)肥4 a 8次，番茄種植土壤的銨態(tài)氮含量與常規(guī)施肥處理間沒(méi)有顯著性差異，表明該肥料中的固氮菌可通過(guò)生物固氮完全滿足番茄生長(zhǎng)所需的氮素供應(yīng)。同時(shí)，連續(xù)4 a施用該生物有機(jī)肥處理土壤的有效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量較常規(guī)施肥處理分別顯著提高147.0%，38.8%，35.6%。表明該生物肥所含的解磷菌和解鉀菌能夠高效分解土壤中難溶態(tài)磷和鉀供植物吸收；而肥料中的腐殖酸、黃腐酸鉀等有機(jī)載體也可顯著提高土壤的有機(jī)質(zhì)含量。

表2 連續(xù)施用生物有機(jī)肥對(duì)土壤養(yǎng)分含量的影響

2.3 連續(xù)4 a施用含高效固氮菌生物有機(jī)肥對(duì)土壤細(xì)菌群落組成的影響

由圖1可以看出，在屬水平上，連續(xù)4 a施用該生物有機(jī)肥可降低番茄種植土壤溶桿菌(Lysobacter)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)、硝化螺菌屬(Nitrospira)、芽單胞菌(Gemmatimonadaceae)、藍(lán)藻細(xì)菌(Cyanobacteria)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、假單胞菌(Pseudomonas)、噬纖維細(xì)菌(Cytophagaceae)的相對(duì)豐度；提高鏈霉菌屬(Streptomyces)、特呂珀菌屬(Truepera)、鹽單胞菌(Halomonas)、尿素芽孢桿菌(Ureibacillus)、海源菌(Idiomarina)和芽孢桿菌(Bacillus)的相對(duì)豐度。由圖2可以看出，在種水平上，連續(xù)施用該生物有機(jī)肥可顯著提高土壤芽孢桿菌中阿氏芽孢桿菌(Bacillusasahii)的相對(duì)豐度。

CK.常規(guī)施肥處理；FTB.連續(xù)4 a施用生物有機(jī)肥。圖2同。

圖2 不同施肥方式土壤細(xì)菌種水平差異顯著性

2.4 連續(xù)4 a施用含高效固氮菌生物有機(jī)肥對(duì)土壤微生物多樣性指數(shù)的影響

由表3可以看出，連續(xù)施用生物有機(jī)肥4 a的番茄種植土壤微生物Coverage和Simpson指數(shù)均高于常規(guī)施肥對(duì)照，Chao和Shannon指數(shù)低于常規(guī)施肥對(duì)照，表明生物有機(jī)肥可在一定程度上提高土壤微生物的覆蓋度和優(yōu)勢(shì)度。

表3 連續(xù)施用生物有機(jī)肥對(duì)土壤微生物多樣性指數(shù)的影響

3 討論與結(jié)論

土壤是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng)的重要場(chǎng)所，也是微生物參與化學(xué)反應(yīng)的載體[8]。不同的施肥措施對(duì)土壤肥力及微生態(tài)環(huán)境影響較大。許云翔等[9]報(bào)道，施用生物炭6 a后，稻田土壤有機(jī)碳、有效磷和速效鉀含量顯著增加，增幅分別為34.6%，12.4%，26.2%。大量研究表明，生物肥料能將土壤中難溶態(tài)的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為可溶性養(yǎng)分供植物吸收，既可培肥地力，又能改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)[10]。庫(kù)永麗等[11]報(bào)道，微生物肥料可顯著提高獼猴桃果園土壤細(xì)菌、放線菌與真菌的比值，提高土壤肥力；同時(shí)，獼猴桃果實(shí)的維生素C和可溶性糖含量提高，可滴定酸含量下降。陳龍等[12]報(bào)道，微生物肥料替代15%化肥對(duì)干旱區(qū)玉米生長(zhǎng)的影響與當(dāng)?shù)刈罴咽┓仕綗o(wú)顯著差異，但可改善土壤微生物環(huán)境。王文慶等[13]報(bào)道，施用0681微生物肥料可以改善土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)土壤的持水、緩沖、保肥能力，減輕山藥病害發(fā)生。Li等[14]報(bào)道，生物肥料替代40%的化學(xué)肥料可以顯著提高土壤有機(jī)碳和可溶性有機(jī)碳含量，增加土壤中芽孢桿菌、木霉菌和假單胞菌等益生菌的豐度，降低鐮刀菌和輪枝菌等病原菌的數(shù)量。筆者團(tuán)隊(duì)前期報(bào)道，施用含高效固氮菌、解磷菌、解鉀菌和拮抗菌生物有機(jī)肥替代化學(xué)肥料，可使設(shè)施番茄產(chǎn)量提高18.81%～22.30%[15]，但其對(duì)土壤生物學(xué)特性的影響尚不清楚。磷和鉀是植物生長(zhǎng)所需的重要元素，但土壤中95%以上的磷和90%～98%的鉀不能被植物直接吸收利用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)4 a穴施8次豐田寶生物有機(jī)肥完全替代化學(xué)肥料，可滿足番茄生長(zhǎng)所需的氮素供應(yīng)，這可能與高效固氮菌的生物固氮作用有關(guān)；還可顯著提高土壤有效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量，這可能與該肥料中添加的解磷菌、解鉀菌及磷礦粉、鉀礦粉有關(guān)。同時(shí)，該肥料也顯著提高了番茄果實(shí)的糖酸比、Vc和番茄紅素的含量，改善了番茄的綜合品質(zhì)。

由于土壤微生物種類(lèi)繁多、數(shù)量巨大，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法難以全面反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的實(shí)際情況[17]。高通量測(cè)序技術(shù)為土壤微生物多樣性分析提供了極大的技術(shù)支持。任天寶等[18]采用高通量測(cè)序技術(shù)研究表明，以生物炭處理的植煙土壤放線菌門(mén)(Proteobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、裝甲菌門(mén)(Armatimonadetes)的群落豐度明顯提高。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，常規(guī)施肥處理的番茄種植土壤中硝化螺菌的相對(duì)豐度較高，可能與化學(xué)氮肥的大量施用有關(guān)[19]，導(dǎo)致部分銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮；溶桿菌和芽單胞菌相對(duì)豐度較高，可能是由于其與硝態(tài)氮呈正相關(guān)[20]；噬纖維細(xì)菌的相對(duì)豐度較高，這可能與雞糞中纖維素含量較高有關(guān)[21]。連續(xù)4 a施用含高效固氮菌生物有機(jī)肥處理的番茄種植土壤鏈霉菌屬相對(duì)豐度較高，可能是由于其與土壤有效磷呈正相關(guān)[19]；特呂珀菌屬、尿素芽孢桿菌和芽孢桿菌的相對(duì)豐度較高，表明該生物肥可提高土壤益生菌的相對(duì)豐度[22-23]，其中對(duì)阿氏芽孢桿菌的提高效果最為顯著，這與Wang等[24]報(bào)道的以海藻肥替代化學(xué)肥料種植番茄可顯著提高土壤阿氏芽孢桿菌相對(duì)豐度的結(jié)果一致。Feng等[25]也報(bào)道，土壤阿氏芽孢桿菌對(duì)有機(jī)肥處理的反應(yīng)最直接，其需要2～4 a的時(shí)間演變成為土壤優(yōu)勢(shì)種群，土壤阿氏芽孢桿菌相對(duì)豐度的提高對(duì)作物產(chǎn)量和土壤肥力的提高具有重要意義。由此可見(jiàn)，連續(xù)4 a施用含高效固氮菌生物有機(jī)肥可提高土壤益生菌的相對(duì)豐度，改良土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)，有利于番茄健壯栽培。

微生物群落結(jié)構(gòu)可通過(guò)多種指數(shù)進(jìn)行表征[26]。Chao指數(shù)是主要用于估計(jì)群落樣品中包含的物種總數(shù)。Coverage指數(shù)是一個(gè)較為常用的測(cè)序深度指數(shù)，其在計(jì)算中加入了只含有1條序列的OUT數(shù)目和抽樣中出現(xiàn)的總序列數(shù)目，能較為真實(shí)的反映樣品的測(cè)序深度。Shannon指數(shù)考慮到樣品中的分類(lèi)總數(shù)和每個(gè)分類(lèi)所占的比例，群落多樣性越高，物種分布越均勻，Shannon指數(shù)越大。Simpson指數(shù)通過(guò)計(jì)算隨機(jī)取樣的2個(gè)個(gè)體屬于不同種的概率，來(lái)表征群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度[27-28]。提高微生物群落的多樣性有助于提高土壤生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力、穩(wěn)定性和可持續(xù)性[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)施用該生物有機(jī)肥4 a的番茄種植土壤，其微生物Coverage和Simpson指數(shù)均高于常規(guī)施肥對(duì)照，Chao和Shannon指數(shù)均低于常規(guī)施肥對(duì)照，表明該生物有機(jī)肥可在一定程度上提高土壤微生物的覆蓋度和優(yōu)勢(shì)度。