馮珊珊，徐永清，趙梓頤,李鳳蘭，胡寶忠

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150038)

小麥(TriticumaestivumL.)作為重要的谷類(lèi)作物，其產(chǎn)量對(duì)人類(lèi)的生活具有重大影響。由于嚴(yán)峻的低溫環(huán)境，冬小麥在東北地區(qū)的種植受到嚴(yán)重制約。東農(nóng)冬麥2號(hào)是能在這種嚴(yán)寒條件下生存的冬小麥品種，發(fā)達(dá)的根系是其能夠安全越冬的決定性因素之一，因此，研究其根系生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制對(duì)擴(kuò)大冬小麥在寒地的種植面積具有重要的意義。

膨脹素(Expansin)是一類(lèi)具有非水解活性的擴(kuò)展蛋白[1]，在植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中均具有重要作用。膨脹素在植物中包括EXPA、EXPB、EXLA和EXLB 4個(gè)亞家族[2]。EXPA和EXPB家族的許多基因都已被證實(shí)對(duì)植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響。Gahoonia等[3]研究發(fā)現(xiàn)HvEXPB1在大麥根中特異性表達(dá)，并且直接參與大麥根毛的根原基形成與根毛的伸長(zhǎng)。He等[4]發(fā)現(xiàn)HvEXPB7基因?qū)Υ篼湼纳L(zhǎng)具有促進(jìn)作用。Guo等[5]發(fā)現(xiàn)在大豆中，GmEXPB2基因與根毛的伸長(zhǎng)有關(guān)。Cho等[6]發(fā)現(xiàn)OsEXPB3基因和OsEXPB2基因?qū)λ靖档陌l(fā)育具有重要作用。Zou等[7]發(fā)現(xiàn)OsEXPB2基因的表達(dá)對(duì)水稻根毛的形成及發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，而且當(dāng)OsEXPB2基因沉默時(shí)，會(huì)影響側(cè)根的生成。Han等[8]發(fā)現(xiàn)在氧化脅迫下，過(guò)表達(dá)TaEXPB23基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出比野生型有更高的鮮質(zhì)量和更長(zhǎng)的初生根。Li等[9]也證明過(guò)表達(dá)TaEXPB23基因可促進(jìn)根系生長(zhǎng)并使根系鮮質(zhì)量增加。Lü等[10]發(fā)現(xiàn)玫瑰膨脹素基因RhEXPA4的過(guò)表達(dá)會(huì)提高轉(zhuǎn)基因擬南芥植株側(cè)根的數(shù)量。Lee等[11]發(fā)現(xiàn)敲除擬南芥中的AtEXPA17基因后，植株側(cè)根的形成會(huì)減少，而擬南芥過(guò)表達(dá)該基因會(huì)促進(jìn)植株側(cè)根的形成。擬南芥AtEXPA4、AtEXPA7、AtEXPA9、AtEXPA14、AtEXPA17、AtEXPA18和水稻OsEXPA1、OsEXPA2、OsEXPA3、OsEXPA4、OsEXPA8、OsEXPA17基因也都被證實(shí)與根系的生長(zhǎng)密切相關(guān)[8,12-14]。除此之外，上述的膨脹素基因也都被證實(shí)參與植物抵御外界非生物脅迫的過(guò)程。

現(xiàn)在膨脹素對(duì)冬小麥根系生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制尚未明確。本研究以東農(nóng)冬麥2號(hào)為材料，得到TaEXPB12-A/B/D3個(gè)同源基因。通過(guò)生物信息學(xué)分析了解其基本的生物學(xué)功能；通過(guò)qRT-PCR分析，研究了這3個(gè)基因在小麥不同部位及在低溫、干旱和激素脅迫下的表達(dá)特性及表達(dá)差異，以期為進(jìn)一步研究膨脹素在根系形態(tài)建成中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為冬小麥東農(nóng)冬麥2號(hào)，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物學(xué)研究室提供。RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、DNA提取試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物公司；引物在長(zhǎng)春庫(kù)美生物公司合成；測(cè)序在哈爾濱擎科生物公司完成；試驗(yàn)所需大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、ABA、茉莉酸甲酯、水楊酸、聚乙二醇、LB肉湯、LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、氯仿、甘油等生化試劑均購(gòu)自凱譽(yù)生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因序列克隆 根據(jù)本研究室的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premire 5.0分析，設(shè)計(jì)克隆TaEXPB12-A/B/D基因的特異引物。以?xún)扇~一心期小麥幼苗根為材料，參照說(shuō)明書(shū)使用TransZol Up PlusRNA Kit試劑盒，提取RNA。再以其為模板，獲得cDNA，按照說(shuō)明書(shū)使用TransScript?One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。根據(jù)本研究室轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，以cDNA為模板，TaEXPB12-A利用上游引物F：5′-TAGCCCCTTGGTTTTCTGTC-3′,下游引物R：5′-GTTTCCTAGTGATGTCTTCTTCTTG-3′；TaEXPB12-B利用上游引物F：5′-GCCCATTGGCTTTCT GTCT-3′,下游引物R：5′-CCCTAGCTGGCGTAGTT CA-3′；TaEXPB12-D利用上游引物F：5′-GCCCATTG CCTTTCTGTCT-3′,下游引物R：5′-CCCTAGCTGGC GTAGTTCA-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度均為58.5 ℃。

1.2.2 序列生物信息學(xué)分析 同源性分析：DNAMAN軟件；染色體定位分析：BioEdit軟件；保守結(jié)構(gòu)域分析：NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)；蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析：SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；蛋白質(zhì)的疏水性及親水性預(yù)測(cè)：ExPASy-ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)；蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)。

1.2.3TaEXPB12-A/B/D基因啟動(dòng)子元件分析 利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線(xiàn)網(wǎng)站對(duì)TaEXPB12-A/B/D3個(gè)基因序列的啟動(dòng)子進(jìn)行功能元件預(yù)測(cè)分析。

1.2.4 qRT-PCR分析 挑選顆粒飽滿(mǎn)的種子，用75%酒精消毒12 min，無(wú)菌水沖洗4～5遍，黑暗條件下浸種12 h，25 ℃培養(yǎng)箱黑暗催芽(保持種子濕潤(rùn)即可)12 h。然后將種子平鋪于含有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)室培養(yǎng)至植株長(zhǎng)到兩葉一心期時(shí)，隨機(jī)選取3株長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，以水培為對(duì)照組，在4 ℃、20%PEG、30%PEG、2 μmol/L脫落酸(ABA)、10 μmol/L茉莉酸甲酯(MeJA)以及10 μmol/L水楊酸(SA)分別處理2，6，12，24，48 h，分別取單株的根部，隨即液氮速凍，然后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。以上述處理的冬小麥根cDNA為模板，采用TransStart? Top Green qPCR SuperMix試劑盒(AQ131，北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL。以分蘗期冬小麥的根、莖、葉、分蘗節(jié)的cDNA為模板，用同一試劑盒進(jìn)行組織表達(dá)模式分析。設(shè)計(jì)的引物具體如下：

熒光引物：上游(TaEXPB12-A-F)：5′-GCTCTAG AATGGCTAGTCCAGGC-3′，下游(TaEXPB12-A-R)：5′-CGGGATCCCTAACTGGCGTA-3′；上游(TaEXPB12-B-F)：5′-GCTCTAGAATGGCTAGTCCAGGC-3′，下游(TaEXPB12-B-R)：5′-CGGGATCCCTAGCTGGCGTA-3′；上游(TaEXPB12-D-R)：5′-GCTCTAGAATGGCTAG TCCTGGC-3′，下游(TaEXPB12-D-R)：5′-CGGGATC CCTAGCTGGCGTA-3′。

內(nèi)參引物：上游(β-actin-F)：5′-TCCAATCTAT GAGGGATACACGC-3′，下游(β-actin-R)：5′-TCTT CATTAGATTATCCGTGAGGTC-3′。

1.2.5 TaEXPB12-A、TaEXPB12-B、TaEXPB12-D蛋白亞細(xì)胞定位 表達(dá)載體YFP上含有PmIⅠ酶切位點(diǎn)，而TaEXPB12-A/B/D基因序列上不含PmIⅠ酶切位點(diǎn)，因此，在目的基因TaEXPB12-A/B/D的起始密碼子前和終止密碼子后加入PmIⅠ酶切位點(diǎn)序列，并且加上保護(hù)堿基TTT，利用Primer Premire 5.0軟件設(shè)計(jì)酶切引物(表1)。以已得到的TaEXPB12-A/B/D序列為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度都為58 ℃。用PmIⅠ酶對(duì)PCR產(chǎn)物和載體YFP進(jìn)行單酶切，使用20 μL單酶切體系，37 ℃水浴鍋中2 h，添加1 μL小牛腸堿性磷酸酶(CIP)，再繼續(xù)37 ℃水浴1 h，電泳檢測(cè)，并對(duì)切開(kāi)的質(zhì)粒進(jìn)行膠回收。利用T4連接酶，將上述膠回收的TaEXPB12-A/B/D目的片段和YFP載體片段進(jìn)行連接，使用20 μL連接體系，輕彈混勻，14.5 ℃恒溫箱中過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，菌液PCR鑒定和測(cè)序后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，然后瞬時(shí)侵染洋蔥表皮。為了區(qū)分融合蛋白在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的定位，將洋蔥表皮細(xì)胞用30%蔗糖溶液預(yù)處理20 min，使其質(zhì)壁分離，隨后正常觀(guān)察。

表1 酶切位點(diǎn)添加的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列克隆與同源性分析

目的基因擴(kuò)增獲得846 bp左右的目的條帶，與預(yù)期片段大小相似(圖1)。膠回收，連接T3載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并進(jìn)行菌液PCR鑒定(圖2)。測(cè)序結(jié)果與本研究室的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，成功得到TaEXPB12-A/B/D基因?；蛐蛄刑峤籒CBI注冊(cè)，GenBank登錄號(hào)分別為MT232926、MT232927、MT232928。

M.2K Marker；1-3.菌落PCR產(chǎn)物。

M.2K Marker；1-3.菌液PCR產(chǎn)物。

2.2 序列生物信息學(xué)分析

通過(guò)DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析，3條序列的同源性高達(dá)98.46%(圖3)。通過(guò)BioEdit軟件對(duì)測(cè)序獲得的3條序列進(jìn)行染色體定位分析，結(jié)果顯示序列1、序列2、序列3分別定位在2AL、2BL、2DL染色體上，編碼281個(gè)氨基酸，其長(zhǎng)度均為846 bp，依次命名為：TaEXPB12-A、TaEXPB12-B、TaEXPB12-D。除此之外，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)TaEXPB12基因序列與大麥中的HvEXPB1基因相似性達(dá)95%。

圖3 TaEXPB12-A/B/D的氨基酸同源比對(duì)

TaEXPB12-A/B/D蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析顯示，該蛋白質(zhì)的切割點(diǎn)位于氨基酸25-26位，TaEXPB12-A/B/D基因信號(hào)肽序列完全相同。除此之外，生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，TaEXPB12-A/B/D蛋白均具備膨脹素基因序列特有的結(jié)構(gòu)域DPBB_1，分別位于142-810 bp，142-834 bp，142-834 bp。TaEXPB12-A蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為29.498 31 ku、等電點(diǎn)為9.17、分子式為C1292H1979N369O388S19；TaEXPB12-B蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為29.494 34 ku、等電點(diǎn)為9.16、分子式為C1296H1987N367O388S18；TaEXPB12-D蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為29.496 37 ku、等電點(diǎn)為9.16、分子式為 C1295H1985N367O387S19，3種蛋白質(zhì)均為親水性蛋白。但是蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析顯示，3種蛋白具有3處明顯差異(圖4)，因此，預(yù)測(cè)這3種蛋白可能功能略有差異。

圖4 TaEXPB12-A/B/D編碼的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

2.3 啟動(dòng)子反應(yīng)元件預(yù)測(cè)分析

對(duì)TaEXPB12-A/B/D基因序列的啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，均含有與CBF冷反應(yīng)通路相關(guān)的CRT/DRE元件、光響應(yīng)元件(Light responsive element)、脫落酸響應(yīng)元件(Abscisic acid responsiveness)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(MeJA responsiveness)、干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件(Drought inducibility)、水楊酸響應(yīng)元件(Salicylic acid responsiveness)、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件(Auxin-responsive element)、赤霉素響應(yīng)元件(Gibberellin-responsive element)、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件(Anaerobic induction)、低溫響應(yīng)元件(Low-temperature responsiveness)以及根特異表達(dá)相關(guān)元件ROOTMOTIFTAPOX1、OSE1ROOTNODULE、OSE2ROO-TNODULE和RHE等。

2.4 TaEXPB12-A/B/D基因的表達(dá)特性分析

如圖5所示，qRT-PCR分析結(jié)果顯示，TaEXPB12-A/B/D基因均在根中特異性表達(dá)。如圖6所示，在不同脅迫處理下，TaEXPB12-A/B/D基因表達(dá)趨勢(shì)不同。在4 ℃低溫處理的條件下，TaEXPB12-A/B/D的表達(dá)量都呈下調(diào)趨勢(shì)，其中6～48 h顯著下調(diào)(P<0.05)，且TaEXPB12-A表達(dá)量下降幅度更大。在不同程度的干旱處理后，TaEXPB12-A/B/D的表達(dá)量都呈先上升后下降的趨勢(shì)，但TaEXPB12-A/B/D對(duì)30%PEG更敏感，響應(yīng)更快。在20%PEG的處理?xiàng)l件下，TaEXPB12-A/B/D的表達(dá)量在12 h達(dá)到峰值，TaEXPB12-A/B/D的表達(dá)量均達(dá)到0 h表達(dá)量的1.65倍以上，差異顯著(P<0.05)；在30%PEG的處理?xiàng)l件下，TaEXPB12-A/B/D的表達(dá)量在6 h表達(dá)量最高，約為0 h表達(dá)量的3倍，差異顯著(P<0.05)。在脫落酸和水楊酸的處理?xiàng)l件下，TaEXPB12-A/B/D的表達(dá)量也都呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中TaEXPB12-A/B/D在脫落酸處理?xiàng)l件下3 h時(shí)達(dá)到峰值，為0 h的2.5倍以上，差異顯著(P<0.05)，且TaEXPB12-A的表達(dá)占據(jù)主導(dǎo)地位，其表達(dá)量達(dá)到了0 h的3.5倍以上，高于TaEXPB12-B和TaEXPB12-D，而水楊酸處理?xiàng)l件下在6 h表達(dá)量最高，約為0 h的13.5倍，差異亦顯著(P<0.05)，說(shuō)明其對(duì)脫落酸的響應(yīng)更快(峰值提前)而對(duì)水楊酸的響應(yīng)水平更高(增幅更大)。在茉莉酸甲酯的處理下，TaEXPB12-A/B/D的表達(dá)量都呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，0～6 h略有下降但差異不顯著，而在6 h后，TaEXPB12-A/B/D的表達(dá)量開(kāi)始上升并在48 h表達(dá)量均達(dá)到0 h的5.7倍以上，差異顯著(P<0.05)。從根中的基因表達(dá)量整體來(lái)看，在TaEXPB12-A、TaEXPB12-B和TaEXPB12-D中TaEXPB12-A基因的表達(dá)量相對(duì)較高。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6同。

圖6 不同脅迫處理下TaEXPB12-A/B/D基因的表達(dá)差異

2.5 5TaEXPB12-A、TaEXPB12-B、TaEXPB12-D蛋白亞細(xì)胞定位

將含有YFP質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌進(jìn)行活化，瞬時(shí)侵染洋蔥表皮，然后在熒光顯微鏡下觀(guān)察洋蔥表皮。如圖7所示，在轉(zhuǎn)化有35S∶∶YFP陽(yáng)性對(duì)照載體的洋蔥細(xì)胞中，熒光信號(hào)在整個(gè)細(xì)胞中都有分布。與陽(yáng)性對(duì)照相比，無(wú)論質(zhì)壁分離前后，TaEXPB12-A∶∶YFP、TaEXPB12-B∶∶YFP、TaEXPB12-D∶∶YFP融合蛋白熒光信號(hào)都定位在細(xì)胞壁。結(jié)果說(shuō)明，TaEXPB12-A/B/D主要分布在細(xì)胞壁中，TaEXPB12-A/B/D編碼的蛋白均為細(xì)胞壁蛋白。

A、B.35S∶∶YFP;C、D.35S∶∶TaEXPB12-A-YFP正常;E、F.35S∶∶TaEXPB12-A-YFP質(zhì)壁分離；G、H.35S∶∶TaEXPB12-B-YFP正常;I、J.35S∶∶TaEXPB12-B-YFP質(zhì)壁分離；K、L.35S∶∶TaEXPB12-D-YFP正常;M、N.35S∶∶TaEXPB12-D-YFP質(zhì)壁分離。

3 討論與結(jié)論

多倍體化是維管植物的重要進(jìn)化過(guò)程[15]。多倍體化使水稻、小麥等農(nóng)作物產(chǎn)生了更具有競(jìng)爭(zhēng)力的新表型，從而在優(yōu)勝劣汰的自然界留存下來(lái)。多倍體化是多倍體物種形成和進(jìn)化的基礎(chǔ)[16]。因此，研究小麥膨脹素同源基因的表達(dá)差異對(duì)了解小麥的異源多倍體進(jìn)化具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)在冬小麥的基因組中，位于不同染色體上的膨脹素同源基因的序列、立體構(gòu)象存在差異。Hu等[17]研究發(fā)現(xiàn)TaEXPA1-A和TaEXPA1-D基因在幼葉中表達(dá)，而TaEXPA1-B在幼葉中沉默。Peng等[18]發(fā)現(xiàn)TaEXPA8-A和TaEXPA8-B主要在根中表達(dá)，而TaEXPA8-D主要在花中表達(dá)。董佳敏等[19]發(fā)現(xiàn)在不同的非生物脅迫下，TaEXPA7-A/B/D基因均下調(diào)表達(dá)，但B染色體組上的TaEXPA7-B基因占主要的表達(dá)優(yōu)勢(shì)。趙巧芩[20]發(fā)現(xiàn)TaEXPA4-A/B/D在抵御不同非生物脅迫的過(guò)程中，表達(dá)量存在顯著差異。在本研究中，TaEXPB12-A、TaEXPB12-B和TaEXPB12-D的同源性很高，在不同非生物脅迫的處理下，3個(gè)同源基因的表達(dá)趨勢(shì)也一致，但A染色體組上的TaEXPB12-A基因表達(dá)量較高。

本研究發(fā)現(xiàn)TaEXPB12-A/B/D基因在根中特異性表達(dá)，而且通過(guò)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其基因序列與大麥中的HvEXPB1基因相似性達(dá)95%。參考小麥與大麥的進(jìn)化關(guān)系和基因之間的相似程度，推測(cè)該基因在功能上基本與HvEXPB1一致。已有研究證實(shí)HvEXPB1在大麥根中特異性表達(dá)，并且直接參與大麥根毛的根原基形成與根毛的伸長(zhǎng)。因此，推測(cè)TaEXPB12-A/B/D基因可能參與小麥根毛的根原基形成與根毛的伸長(zhǎng)。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，在低溫條件下，TaEXPB12-A/B/D基因的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，這可能是為了減少根的表面積，從而減少寒脅迫所造成的傷害。在干旱條件下，TaEXPB12-A/B/D基因的表達(dá)量會(huì)先上升，這可能是植物受到旱脅迫早期為了增強(qiáng)吸水能力而促進(jìn)根毛生長(zhǎng)的緣故。TaEXPB12-A/B/D基因編碼的蛋白是細(xì)胞壁蛋白，它們可能通過(guò)修飾細(xì)胞壁來(lái)幫助植物抵御外界的非生物脅迫。在啟動(dòng)子分析中，發(fā)現(xiàn)了與CBF冷反應(yīng)通路相關(guān)的CRT/DRE元件，這說(shuō)明TaEXPB12-A/B/D可能在CBF冷反應(yīng)通路中承擔(dān)著一定的角色。但TaEXPB12-A/B/D基因在小麥根系生長(zhǎng)發(fā)育中的具體作用還需要進(jìn)一步的研究。

分別定位于2AL、2B、2DL染色體上的TaEXPB12-A/B/D同源基因，其CDS序列長(zhǎng)度均為846 bp，編碼281個(gè)氨基酸。TaEXPB12-A/B/D基因高度同源，編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)相似，其編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)有3處明顯差異，這可能使它們的功能有所不同。這3段序列的啟動(dòng)子區(qū)域中均含有與根特異表達(dá)相關(guān)的作用元件，以及大量激素響應(yīng)元件和非生物脅迫響應(yīng)元件。TaEXPB12-A/B/D蛋白在冬小麥根的細(xì)胞壁中特異性分布，并參與冬小麥抵御干旱、低溫、ABA、SA和MeJA的過(guò)程。