張 浩，柳 絮，宣 寧，張 華，高瑞鈺，趙倩倩，姚方印

(1.山東師范大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100)

水稻抽穗期(Heading stage)作為水稻生命活動(dòng)的一個(gè)重要生理時(shí)期，它決定了水稻品種的種植區(qū)域和環(huán)境適應(yīng)性。水稻的抽穗期(開花時(shí)間)主要是由感光性(Photoperiod sensitivity，PS)、感溫性(Temperature sensitivity，TS)和基本營養(yǎng)生長狀況(Basic vegetative growth，BVG)3個(gè)因素決定的[1]。水稻屬于短日照植物，一般來說在長日照條件下抽穗期延長，短日照條件下抽穗期縮短，高溫環(huán)境下抽穗期縮短，低溫環(huán)境下抽穗期延長。水稻營養(yǎng)物質(zhì)的積累時(shí)間和光合作用的長短，及籽粒的灌漿時(shí)間和生長進(jìn)程都受到抽穗期的影響,因此，要使種植品種達(dá)到高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的效果，必需關(guān)注抽穗期這一性狀。研究學(xué)者從粳稻品種日本晴和秈稻品種(Kasalath)雜交后代的分離群體中鑒定出了一定數(shù)量的與開花調(diào)控有關(guān)的QTLs，包括Hd1、Hd2/Ghd7.1/OsPRR37、Hd3a、Ghd7和DTH8/Ghd8[1-5]。一些開花基因如Ghd7、DTH8等存在一因多效現(xiàn)象，這些基因不僅能作為主效基因調(diào)控水稻的生育期，同時(shí)可以通過調(diào)控生長發(fā)育過程和植株的形態(tài)結(jié)構(gòu)來調(diào)控水稻產(chǎn)量構(gòu)成因素。DTH8(Ghd8/Hd5)是株高和抽穗期多效性控制基因，全長1 156 bp，含有1個(gè)外顯子，編碼一個(gè)由297個(gè)氨基酸組成的多肽[2,5-6]。DTH8在許多組織中表達(dá)，長日照條件下能下調(diào)Ehd1和Hd3a的轉(zhuǎn)錄，且獨(dú)立于Ghd7和Hd1；DTH8通過調(diào)節(jié)Ehd1、RFT1和Hd3a使水稻開花期延長，但短日照條件下促進(jìn)水稻提前開花[5]。長日照條件下，導(dǎo)入Asominori中有功能的DTH8等位基因能顯著增加CSSL61的抽穗期和株高[6]。綜上所述，DTH8不僅能同時(shí)調(diào)控水稻的生育期、株高和產(chǎn)量性狀，還能調(diào)控分蘗數(shù)和穗部分枝，當(dāng)DTH8突變后，能有效減弱水稻的光周期敏感性。

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Inter-spaced Short Palindromic Repeat，CRISPR)技術(shù)是近幾年來發(fā)展較快的一項(xiàng)基因編輯技術(shù)，它具有精準(zhǔn)、高效、快捷等優(yōu)點(diǎn)[7]，通過核酸酶引起靶位點(diǎn)處的DNA雙鏈斷裂，激活細(xì)胞內(nèi)非同源末端連接(Nor homologous End Joining，NHEJ)和同源重組(Homologous Recombination，HR)2種修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)不但在酵母、人、鼠、果蠅中廣泛應(yīng)用[8-11]，在擬南芥、小麥、甜橙、煙草、水稻、玉米等植物中也實(shí)現(xiàn)了基因的定點(diǎn)編輯[12-16]。該技術(shù)在多種生物中已逐漸成為一種成熟的基因組編輯工具，在研究基因功能方面具有一定的促進(jìn)作用[17]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)即成簇的、有規(guī)律的、間隔短回文重復(fù)序列在古細(xì)菌和細(xì)菌中普遍存在，能夠?yàn)闄C(jī)體提供一種特異性免疫保護(hù)機(jī)制[18]。CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠特異地識(shí)別外源DNA，切割外源DNA造成基因的沉默。由于Ⅰ型和Ⅲ型結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在切割DNA鏈時(shí)，需要多個(gè)Cas蛋白形成復(fù)合體發(fā)揮作用，而Ⅱ型系統(tǒng)在對(duì)靶DNA進(jìn)行切割時(shí)，只需一個(gè)Cas9蛋白即可，該系統(tǒng)中只含有一個(gè)Cas9蛋白和一小段sgRNA序列，約20 bp，主要用來識(shí)別目的序列，Cas9指導(dǎo)前體crRNA的成熟和對(duì)外源DNA的切割。DNA雙鏈斷裂能夠引起細(xì)胞內(nèi)的自我修復(fù)機(jī)制，非同源末端連接保真度較低，在切割位點(diǎn)能夠引起堿基的缺失或插入，造成基因沉默或移碼突變等，都可能導(dǎo)致基因失去功能；在修復(fù)過程中，若存在DNA模板時(shí)，則會(huì)啟動(dòng)高保真的同源重組修復(fù)機(jī)制，通過插入一段同源序列與目的基因進(jìn)行同源交換，從而完成基因組的定向精準(zhǔn)編輯[19]。

香糯99-25稻米品質(zhì)優(yōu)良，全生育期168 d，抗倒伏，抽穗期較晚，抗病能力一般，產(chǎn)量約9 000～9 750 kg/hm2。生產(chǎn)上對(duì)照品種臨稻10號(hào)于8月25日抽穗，香糯99-25于9月6日抽穗，大約比生產(chǎn)上對(duì)照品種臨稻10號(hào)晚11 d左右，極大地制約了其在生產(chǎn)上的應(yīng)用。由于我國北方地區(qū)秋冬兩季長日低溫，不適宜種植熟期較長的水稻品種，在一定程度上限制了一些高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)水稻品種的種植。不少研究表明，水稻的生物學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)產(chǎn)量會(huì)隨著抽穗期的縮短而降低[20]，如果能利用基因編輯技術(shù)對(duì)控制抽穗期的基因進(jìn)行編輯，將有利于培育早熟、豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源，對(duì)于水稻研究進(jìn)展的各個(gè)方面及指導(dǎo)今后的育種工作、品種改良都具有極其重要的意義。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)水稻抽穗期DTH8基因進(jìn)行了編輯，獲得了抽穗期較野生型香糯99-25明顯提前的突變體水稻材料，結(jié)合田間抽穗期調(diào)查，結(jié)果符合預(yù)期，為后續(xù)DTH8基因功能的研究提供了重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)使用的水稻野生型粳稻品種香糯99-25，該品種農(nóng)藝性狀優(yōu)良，在黃淮區(qū)抽穗期比生產(chǎn)上主栽品種平均晚抽穗10 d左右，限制了在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用。該品種夏季種植在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飲馬泉試驗(yàn)基地，冬季種植在三亞南繁站試驗(yàn)田。

1.2 菌株、質(zhì)粒和載體

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞來自上海生工生物工程有限公司，EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞來自濟(jì)南博門特生物科技有限公司，本試驗(yàn)所采用的CRISPR/Cas9載體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉耀光老師提供。系統(tǒng)包括2個(gè)載體，分別為中間載體和表達(dá)載體。中間載體AtU6-26-sgRNA-SK構(gòu)建Single Guide RNA(sgRNA)cassette，表達(dá)載體pCAMBIA1300-YAO∶Cas9轉(zhuǎn)化植物。

1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶BsaⅠ、SpeⅠ和NheⅠ(New England Biolabs)，DNA連接酶T4DNA ligase(TaKaRa)；質(zhì)粒提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；卡那霉素(Kanamycin)、氨芐青霉素(Ampicillin)(上海先鋒藥業(yè)公司)；DNA測(cè)序服務(wù)(上海生工生物工程有限公司)；本研究所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

表1 本研究所用的引物

1.4 靶點(diǎn)的選擇及sgRNA設(shè)計(jì)

在CRISPR-P網(wǎng)站(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)輸入DTH8基因序列號(hào)進(jìn)行靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)。根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)識(shí)別PAM上游大約20個(gè)堿基序列的特點(diǎn)來篩選合適的靶位點(diǎn)[21]，通過Blast分析進(jìn)行靶位點(diǎn)特異性的比對(duì)驗(yàn)證。確定靶位點(diǎn)后，在靶位點(diǎn)序列前面加上BsaⅠ限制性內(nèi)切酶的黏性末端的接頭，具體引物序列見表1。

1.5 CRISPR-Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建

用雙蒸水將靶點(diǎn)引物(DTH8-M1F/R、DTH8-M2F/R)稀釋到10 μmol/L，通過退火形成引物二聚體，F(xiàn)引物和R引物各取1 μL加8 μL ddH2O稀釋，沸水浴30 s立刻取出，自然冷卻。通過限制性內(nèi)切酶BsaⅠ酶切將AtU6-26-sgRNA-SK載體線性化，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收酶切產(chǎn)物，利用T4連接酶將目的片段(Target)連接到線性化AtU6-26-sgRNA-SK載體上，用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，次日挑取單克隆菌落用U6-sgRNA-F和DTH8-M1R進(jìn)行菌落PCR鑒定，并測(cè)序驗(yàn)證。獲得的中間載體AtU6-26-sgRNA-SK-DTH8用SpeⅠ和NheⅠ雙酶切后，切膠回收約642 bp的片段，與SpeⅠ酶切后的pCAMBIA1300∶Cas9載體通過T4DNA連接酶進(jìn)行連接，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，次日挑取單克隆菌落用1300-F和1300-R進(jìn)行菌落PCR鑒定，并測(cè)序驗(yàn)證，獲得雙元載體CRISPR-DTH8。

1.6 T0轉(zhuǎn)基因植株的獲得與檢測(cè)

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CRISPR-DTH8載體轉(zhuǎn)入香糯水稻愈傷組織，利用潮霉素進(jìn)行篩選。在分蘗盛期，采用CTAB法[22]提取水稻T0基因編輯植株葉片DNA，利用潮霉素引物Hpt-F/R對(duì)載體中的潮霉素抗性基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到基因編輯陽性植株。

1.7 轉(zhuǎn)基因植株的突變檢測(cè)及qRT-PCR分析

分蘗盛期取基因編輯植株葉片，采用CTAB法[22]提取水稻基因組DNA。根據(jù)不同靶位點(diǎn)所在位置的附近序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物對(duì)不同靶位點(diǎn)的突變類型進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)試驗(yàn)中的靶位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因陽性植株設(shè)計(jì)2對(duì)引物DTH8-1-F/R、DTH8-2-F/R(表1)分別進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。PCR體系：DNA模板2 μL,2×Power Taq PCR Master Mix 10 μL,正向引物1 μL,反向引物 1 μL,ddH2O 6 μL混合，共20 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。經(jīng)120 V 1%瓊脂糖凝膠電泳25 min，將產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，并利用DNAMAN對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

采用TRIzol法[23]提取突變體及野生型葉片總RNA。首先利用DNase Ⅰ處理總RNA，以消化處理后的RNA為模板，采用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，然后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法分析DTH8在野生型和突變體中的表達(dá)量，其中Ubiquitin基因作為內(nèi)參基因。qRT-PCR體系：cDNA模板2 μL，正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，2×SYBR qPCR Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，共計(jì) 25 μL。PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 30 s，42個(gè)循環(huán)。利用公式2-ΔΔCT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.8 突變體表型分析

1.8.1 抽穗期及主要農(nóng)藝性狀調(diào)查 T1種植篩選得到的基因型純合的株系，野生型和每個(gè)突變體各種植40株。野生型材料和每個(gè)突變體材料各調(diào)查20株的抽穗期，求其平均抽穗期；同時(shí)考察株高、每穗實(shí)粒數(shù)、千粒質(zhì)量、穗長等產(chǎn)量性狀，獲得數(shù)據(jù)通過SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8.2 通過t檢驗(yàn)驗(yàn)證基因編輯的抽穗期 利用t檢驗(yàn)來比較野生型水稻材料和不同突變體之間的差異顯著性。以概率α=10-6為閾值，即當(dāng)突變體的抽穗天數(shù)與對(duì)照抽穗天數(shù)之間的t檢驗(yàn)的P≤10-6時(shí)，證明該突變體上基因編輯引起了抽穗期的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建DTH8的CRISPR-Cas9表達(dá)載體

分析DTH8基因序列，設(shè)計(jì)引物DTH8-M1F和DTH8-M1R、DTH8-M2F和DTH8-M2R，將退火后的靶點(diǎn)DTH8-M1、DTH8-M2分別與BsaⅠ 酶切后的AtU6-26-sgRNA-SK(圖1-A)連接，連接后轉(zhuǎn)化涂板過夜培養(yǎng)后挑單克隆菌，通過菌落PCR檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳后片段大小為499 bp(圖1-C)，連接正確。菌液經(jīng)過搖菌提質(zhì)粒(PCR產(chǎn)物)分別測(cè)序，測(cè)序結(jié)果含有靶點(diǎn)DTH8-M1、DTH8-M2證明連接正確。

M.DL5000 DNA 標(biāo)記(由大到小分別為5 000，3 000，1 500，1 000，750，500，250，100 bp)；A.AtU6-26-sgRNA-SK 酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；1.AtU6-26-sgRNA-SK質(zhì)粒；2-3.AtU6-26-sgRNA-SK質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；B.AtU6-26-sgRNA-SK-靶點(diǎn)質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；1-6.AtU6-26-sgRNA-SK-靶點(diǎn)質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；C.AtU6-26-sgRNA-SK-靶點(diǎn)菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳圖；1-17.AtU6-26-sgRNA-SK-靶點(diǎn)菌落1-17；D.pCAMBIA1300-DTH8-M1菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳圖；1-14.pCAMBIA1300-DTH8-M1菌落1-14；E.pCAMBIA1300-DTH8-M1-DTH8-M2菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳圖；1-15.pCAMBIA1300-DTH8-M1-DTH8-M2菌落1-15。

挑菌后提質(zhì)粒分別進(jìn)行NheⅠ和SpeⅠ雙酶切，回收大約為642 bp的片段(圖1-B)，得到DTH8-M1-sgRNA cassette、DTH8-M2-sgRNA cassette，然后分別與SpeⅠ單酶切后的pCAMBIA1300∶Cas9質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，菌落PCR檢測(cè)電泳片段約為750 bp(圖1-D)，測(cè)序結(jié)果包含靶點(diǎn)DTH8-M1、DTH8-M2。選取正確的菌落過夜培養(yǎng)搖菌提取pCAMBIA1300-DTH8-M1、pCAMBIA1300-DTH8-M2質(zhì)粒。基因編輯單靶點(diǎn)載體pCAMBIA1300-DTH8-M1、pCAMBIA1300-DTH8-M2 構(gòu)建完成。命名為CRISPR-DTH8-1、CRISPR-DTH8-2。將DTH8-M2-sgRNA cassette與SpeⅠ單酶切后的pCAMBIA1300-DTH8-M1質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化涂板過夜培養(yǎng)后挑取單克隆菌，PCR檢測(cè)電泳片段約為1 500 bp(圖1-E)，測(cè)序結(jié)果包含靶點(diǎn)DTH8-M1和DTH8-M2。選取正確的菌落過夜培養(yǎng)搖菌提取pCAMBIA1300-DTH8-M1-DTH8-M2質(zhì)粒?；蚓庉嬰p靶點(diǎn)載體構(gòu)建完成，命名為CRISPR-DTH8-M1-DTH8-M2。

2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及T0轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)

使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法共獲得30株再生植株，利用CTAB法提取水稻葉片DNA，用潮霉素鑒定Cas9載體元件是否整合到再生植株基因組上，經(jīng)潮霉素篩選標(biāo)記，特異性擴(kuò)增的片段大小為557 bp，結(jié)果表明，在獲得的30株T0再生苗中有29株能擴(kuò)增出目的條帶，說明這些植株均為基因編輯陽性植株，陽性轉(zhuǎn)化率約為96.7%(圖2)。

M.DL2000 DNA標(biāo)記(由大到小分別為2 000，1 000，750，500，250，100 bp)；Hpt引物對(duì)CRISPR-DTH8-1-DTH8-2轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR檢測(cè)；B.空白對(duì)照；N.陰性對(duì)照；P.陽性對(duì)照。

2.3 靶位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果及突變類型分析

利用設(shè)計(jì)好的特異性引物對(duì)陽性植株進(jìn)行擴(kuò)增，通過對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序發(fā)現(xiàn)靶位點(diǎn)1附近未發(fā)生突變；靶位點(diǎn)2附近發(fā)生了2種類型的堿基置換和插入突變。通過劉耀光課題組的DSDecode解碼方法(http:/cbi.hzau.edu.cn/crispr/)，分析該突變體的具體堿基突變類型，編號(hào)為DTH8-5、DTH8-10、DTH8-12、DTH8-21結(jié)果顯示在外顯子第602號(hào)堿基G被C替換、603號(hào)堿基T被C替換、609號(hào)堿基G被T替換、610號(hào)堿基C被G替換、614號(hào)堿基A被C替換、615號(hào)堿基G被C替換、620號(hào)堿基G被T替換的純合突變類型(圖3)；該類型突變導(dǎo)致靶位點(diǎn)編碼蛋白的第201位氨基酸處形成甘氨酸→丙氨酸的置換；第203位氨基酸處形成谷氨酰胺→組氨酸的置換；第204位氨基酸處形成谷氨酰胺→谷氨酸的置換；第205位氨基酸處形成谷氨酰胺→脯氨酸的置換；第207位氨基酸處形成甘氨酸→纈氨酸的置換；DTH8-9、DTH8-17結(jié)果顯示在外顯子872號(hào)堿基G被A替換，導(dǎo)致第291位氨基酸由精氨酸→賴氨酸的置換。DTH8-2測(cè)序結(jié)果顯示在外顯子第671號(hào)堿基后面插入堿基AA，結(jié)果導(dǎo)致第234位氨基酸處發(fā)生提前終止(圖3)。

灰色字體.靶位點(diǎn)序列；下劃線.候選識(shí)別位點(diǎn)的毗鄰基序(PAM)序列；方框.插入堿基；黑色陰影.替換堿基；省略號(hào).中間省略的堿基序列。

2.4 轉(zhuǎn)基因T0表型及RNA表達(dá)水平分析

在T0獲得轉(zhuǎn)基因苗30株，其中陽性苗29株，編號(hào)分別為DTH8-1～15、DTH8-17～30。其中，有7份材料較野生型相比抽穗期提前，分別為DTH8-2、DTH8-5、DTH8-9、DTH8-10、DTH8-12、DTH8-17、DTH8-21(圖4-A)，其余材料均表現(xiàn)為正常表型。進(jìn)一步研究了DTH8基因在T0的表達(dá)情況，對(duì)香糯99-25和7個(gè)突變體材料的抽穗期基因進(jìn)行了RNA表達(dá)水平的檢測(cè)。提取了8組材料抽穗期葉片總RNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，定量分析了DTH8基因的表達(dá)情況，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，突變體材料中DTH8基因在RNA水平下表達(dá)量呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)(圖4-B)。該結(jié)果有力地證明了DTH8基因外顯子的堿基置換或插入影響了該基因的轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致該基因在突變體材料DTH8-2、DTH8-9和DTH8-17中表達(dá)顯著下調(diào)。

A.香糯99-25及DTH8突變體植株表現(xiàn)；a.WT；b.突變體；B.香糯99-25及DTH8突變體中DTH8 RNA水平。不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著(P<0.05)。圖5同。

2.5 T1植株性狀分析

在T1隨機(jī)挑選了野生型材料和純合的7個(gè)突變株系各20株，進(jìn)一步對(duì)其抽穗期進(jìn)行考察。經(jīng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析表明，DTH8基因成功編輯后代DTH8-2、DTH8-9、DTH8-17的抽穗期與野生型香糯99-25有顯著性差異。以概率α=10-6為閾值，根據(jù)P≤10-6，結(jié)果表明，所調(diào)查的突變體植株抽穗期與對(duì)照存在顯著差異；值得注意的是，在考察的野生型和7個(gè)突變株系的株高、每穗實(shí)粒數(shù)、千粒質(zhì)量和穗長等性狀中，7個(gè)突變株系的農(nóng)藝性狀與野生型基本一致，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，除抽穗期外，其他農(nóng)藝性狀與野生型相比均未達(dá)到顯著水平(圖5)。進(jìn)一步證明了突變體抽穗期的變化是由于編輯抽穗期基因DTH8引起的。

圖5 野生型與T1 DTH8突變體的農(nóng)藝性狀

3 結(jié)論與討論

抽穗期作為決定水稻品種的地域種植和季節(jié)適應(yīng)性的重要生理時(shí)期[24]，近年來，受到育種工作者的關(guān)注。我國北方地區(qū)地處秦嶺-淮河以北，內(nèi)蒙古高原以南，大興安嶺、青藏高原以東，主要包括東北地區(qū)和華北地區(qū)，約占全國面積的20%，由于秋冬兩季長日低溫，在水稻育種過程中，不適宜種植抽穗期較長的水稻品種，同時(shí)早熟和高產(chǎn)一直是無法兼得的性狀，早熟可能就要面對(duì)光合作用和物質(zhì)積累時(shí)間長度不夠的矛盾，因此，培育適宜在北方地區(qū)種植的提前抽穗的水稻品種具有重要意義。DTH8是一個(gè)控制水稻抽穗期的關(guān)鍵基因，據(jù)報(bào)道顯示，該基因有4個(gè)等位基因，即Ghd8、LHD1、EF8和DTH8。本研究對(duì)抽穗期較晚的粳稻品種香糯99-25中的DTH8基因進(jìn)行了定向編輯，獲得了7個(gè)DTH8功能缺失的早抽穗突變體，與野生型香糯99-25相比，DTH8編碼區(qū)的第602號(hào)堿基G被C替換、603號(hào)堿基T被C替換、609號(hào)堿基G被T替換、610號(hào)堿基C被G替換、614號(hào)堿基A被C替換、615號(hào)堿基G被C替換、620號(hào)堿基G被T替換。Zhang等[25]研究表明，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻進(jìn)行編輯，在T0即可獲得純合的基因突變植株，并且這些突變能夠穩(wěn)定遺傳給下一代。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種DNA分子剪刀，是一種較為成熟的基因編輯技術(shù)，它能夠精準(zhǔn)地對(duì)基因組靶標(biāo)部位進(jìn)行定點(diǎn)編輯，徹底改變基因組序列，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的敲除和編輯。與傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)TALEN和RNAi相比，該技術(shù)更加精準(zhǔn)、操作簡便快捷，同時(shí)具有多靶點(diǎn)突變且敲除效率高等優(yōu)點(diǎn)。自2013年實(shí)現(xiàn)第一次應(yīng)用后，目前已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物、細(xì)菌、真菌基因功能研究中[7]。CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用到水稻[26-27]、玉米[28-29]、小麥[30]、大麥[31]、大豆[32]等多種作物中，并獲得了基因功能缺失的突變體。陳煒等[33]利用此技術(shù)定點(diǎn)敲除水稻葉型相關(guān)基因NRL2，獲得突變體耐旱基因表達(dá)水平顯著低于野生型，進(jìn)一步驗(yàn)證了NRL2影響植物耐旱性。本研究的抽穗期調(diào)查結(jié)果表明，CRISPR/Cas9技術(shù)編輯后獲得的突變體均可促進(jìn)抽穗。由此證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)能高效介導(dǎo)水稻基因組編輯修飾。目前，筆者正在將改良后的純合突變體材料進(jìn)行自交，進(jìn)一步純化其后代的遺傳背景。隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的不斷完善，為定向改良某些水稻品種的主要農(nóng)藝性狀提供了一個(gè)高效、快速、便捷的分子育種方法，并在基因功能的研究、創(chuàng)建基因功能缺失突變體等方面發(fā)揮了重要作用。