王黎霞，黃 芳，張建軍，安 健*

(1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧醫(yī)系；北京 102442；2.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

原蟲的分泌蛋白是蟲體在黏附、入侵宿主細胞及在帶蟲空泡內(nèi)分泌的，惡性瘧原蟲的分泌蛋白與整蟲的免疫原性存在差異[1]。弓形蟲速殖子微線和棒狀體從頂端分泌蛋白，而致密顆粒從蟲體頂端、側(cè)面及后面分泌蛋白[2]。弓形蟲頂端識別宿主細胞后，啟動信號，使蟲體內(nèi)的鈣離子水平升高，刺激微線分泌相關(guān)蛋白[3]，使蟲體黏附、入侵宿主細胞[4]，隨之棒狀體和致密顆粒分泌蛋白形成帶蟲空泡，構(gòu)成空泡內(nèi)微絨毛網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)成分[5]，促進弓形蟲的發(fā)育和分化[6]；外分泌蛋白免疫，增強IL-12、IL-10表達，使小鼠腹腔巨噬細胞的活性降低，影響弓形蟲的入侵和發(fā)育[7]，保護宿主細胞[8]，提高小鼠的保護力[9]；外分泌蛋白也是鑒定感染的重要依據(jù)[10-11]。球蟲感染后，雞腸壁彈性喪失，黏膜脫落，黏膜層變薄，內(nèi)容物中40%～60%的水不被吸收，盡管雞大量飲水但仍然出現(xiàn)脫水癥狀，飼料利用率低，糞便變稀不成形，帶有大量黏液，雞糞便帶血，甚至出現(xiàn)死亡，證明雞球蟲入侵引起腸道上皮組織功能和器質(zhì)上的損傷[12]，受細菌、病毒毒素致病性啟發(fā)，筆者推測球蟲的外分泌蛋白的釋放對雞體也會產(chǎn)生損傷，而在艾美耳球蟲的研究中未見雞球蟲外分泌蛋白致病性的報道[13]，該試驗通過牛腎傳代細胞培養(yǎng)E.acervulina，SDS-PAGE和Western Blot鑒定雞球蟲外分泌蛋白，吖啶橙(OA)和碘化丙啶(PI)染色判定該蛋白對細胞的損傷性，初步研究外分泌蛋白的外毒素功能。

1 材料和方法

1.1 材 料

E.acervulina、牛腎傳代細胞，北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)病理學(xué)實驗室保存；高糖DMEM、犢牛血清，Gibico公司產(chǎn)品；青霉素、胰酶，Orien公司產(chǎn)品；硫酸鏈霉素，Topbio公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1 雞抗E.acervulina血清制備 純化球蟲的子孢子[14]，制備可溶性蛋白加等體積的弗氏完全佐劑，每只200 μL免疫12日齡無球蟲感染的雞，10 d后二免，二免后10 d，心臟采血，分離抗E.acervulina血清[15]。

1.2.2E.acervulina外分泌蛋白分離 子孢子與細胞共培養(yǎng)2.5 h，使子孢子侵入細胞[16]，換入無血清培養(yǎng)液，每隔12 h收集該時間點前12 h的培養(yǎng)液，并換新培養(yǎng)液，至60 h。離心收集培養(yǎng)液上清[17]，透析濃縮，SDS-PAGE、銀染確定外分泌蛋白的大小及分泌時間，抗球蟲血清為一抗，HRP-兔抗雞抗體為二抗，Western Blot確定外分泌蛋白的來源。

1.2.3E.acervulina外分泌蛋白的細胞損傷 牛腎傳代細胞接種到6孔板，每孔100萬細胞，培養(yǎng)2 h，換入新培養(yǎng)液對照組，保持培養(yǎng)過牛腎傳代細胞的培養(yǎng)液對照組，加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組，繼續(xù)培養(yǎng)3.5 h，吖啶橙和碘化丙啶染色鑒定細胞膜和核膜的損傷。

2 結(jié) 果

2.1 不同培養(yǎng)時間的E. acervulina外分泌蛋白SDS-PAGE分析

12～24 h蛋白的條帶最清晰，24～36 h蛋白條帶變暗，36～48 h幾乎看不到蛋白帶，0～12 h和48～60 h看不到外分泌蛋白，表明隨著子孢子的發(fā)育，E.acervulina外分泌蛋白的量不斷減少，見圖1。

2.2 E. acervulina外分泌蛋白的Western Blot鑒定

Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)1條清晰的70 kD反應(yīng)條帶與抗E.acervulina血清反應(yīng)(圖2)，說明該蛋白是E.acervulina分泌的。

2.3 E. acervulina外分泌蛋白對牛腎傳代細胞的損傷

新培養(yǎng)液對照組、培養(yǎng)過牛腎傳代細胞的培養(yǎng)液對照組和加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組在自然光和吖啶橙染色綠色熒光下未發(fā)現(xiàn)差異(圖3A、3D、3G和圖3B、3E、3H)，說明細胞的遺傳物質(zhì)沒有受到損傷；在碘化丙啶染色紅色熒光下，新培養(yǎng)液對照組與培養(yǎng)過牛腎傳代細胞的培養(yǎng)液對照組比較沒有區(qū)別，說明培養(yǎng)過牛腎傳代細胞的培養(yǎng)液對照組對細胞膜和核膜沒有損傷(圖3C、3F)，加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組與新培養(yǎng)液對照組和培養(yǎng)過牛腎傳代細胞的培養(yǎng)液對照組三者比較，加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組的細胞，在細胞形態(tài)上未見改變，碘化丙啶染色紅色熒光細胞明顯增多(圖3C、3F、3I)，說明加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組細胞膜和核膜有損傷。

3 討 論

為了分離E.acervulina的外分泌蛋白，該試驗利用無血清培養(yǎng)，避免培養(yǎng)液中血清蛋白對于試驗結(jié)果的干擾。每間隔12 h收集該時間點前12 h的培養(yǎng)液，濃縮后SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)60 h內(nèi)12～24 h的E.acervulina外分泌蛋白最多，Western Blot鑒定該蛋白約70 kD，該外分泌蛋白是子孢子發(fā)育成為第一代裂殖子過程中向細胞外分泌的。

巨噬細胞游走抑制因子和天冬氨酰轉(zhuǎn)移酶是E.acervulina外分泌蛋白，前者裂殖子期分泌[18]，后者在子孢子的折光體中[19]，與柔嫩艾美耳球蟲有97.4%相似度[20]，入侵時分泌。弓形蟲在入侵時分泌很多蛋白，如MIC系列、溶菌酶、醛縮酶、透明質(zhì)酸酶等[21]，形成帶蟲空泡[22]，滋養(yǎng)體分泌穿透-增強因子，促進蟲體入侵[23]。柔嫩艾美耳球蟲子孢子分泌EtSAG10、EtMIC5和TA4[24]。該試驗分離得到的外分泌蛋白約70 kD，與已知蛋白大小有明顯差異，推測為一種未知蛋白。

弓形蟲外分泌蛋白可提高弓形蟲的穿透能力和繁殖能力[13]，說明外分泌蛋白對寄生細胞和非寄生細胞都有作用，作為信號而影響其他細胞。球蟲寄生的細胞核增大或者減小，細胞質(zhì)空泡化或呈現(xiàn)不規(guī)則，裂殖體成熟，裂殖子溢出細胞時，空泡化不僅在寄生細胞，臨近無寄生細胞也發(fā)生[25]，預(yù)示球蟲外分泌蛋白的毒素作用。

吖啶橙能透過完整細胞膜，用于鑒定雙鏈DNA損傷，與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)綠色熒光，與單鏈核酸結(jié)合發(fā)紅色熒光。碘化丙啶不能透過正常細胞膜和核膜，用于鑒定膜損傷，它與核酸結(jié)合發(fā)出紅色熒光[26]。該試驗中，新培養(yǎng)液對照組、培養(yǎng)過牛腎傳代細胞的培養(yǎng)液對照組和加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組在自然光和吖啶橙染色綠色熒光下無差異，說明細胞核酸沒有受損；在碘化丙啶染色紅色熒光下，新培養(yǎng)液對照組與培養(yǎng)過牛腎傳代細胞的培養(yǎng)液對照組比較無差異，說明培養(yǎng)過牛腎傳代細胞的培養(yǎng)液對照組細胞膜沒有受損，加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組與新培養(yǎng)液對照組和培養(yǎng)過牛腎傳代細胞的培養(yǎng)液對照組三者比較，加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組的細胞，在細胞形態(tài)上改變不是很大，紅色熒光細胞明顯增多，說明加球蟲外分泌蛋白的培養(yǎng)液試驗組膜有損傷，它引起細胞膜、核膜的通透性增加。該蛋白可能與第一代裂殖子從細胞溢出、入侵新的宿主細胞有關(guān)，同時，該外分泌蛋白具有球蟲外毒素的功能，也具備作為球蟲免疫的候選抗原的可能性，而該蛋白是否促進裂殖子溢出、入侵新的細胞、是否有免疫原性及在雞體是否具有同樣作用需進一步研究。

該試驗通過牛腎傳代細胞培養(yǎng)、SDS-PAGE和Western Blot發(fā)現(xiàn)一條70 kD的E.acervulina外分泌蛋白，在第一代裂殖體形成中分泌，它引起細胞膜和核膜的通透性增加，說明該E.acervulina外分泌蛋白具有球蟲外毒素的功能。