邱凱男，張 杰，宋婷婷

(北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

鈍葉酢漿草(Oxalisobtusa)屬于酢漿草科酢漿草屬，廣布于非洲納米比亞的納馬夸蘭區(qū)和克尼斯納區(qū)，生長(zhǎng)在砂土或黏土中，株高10～35 cm，全株被有疏柔毛，莖短縮，葉基生，蓮座狀，掌狀復(fù)葉，3小葉，倒心形，小葉無柄，形狀大小略有不同。花單生，顏色豐富，在不同的光照條件和溫度下有不同的花色，是秋季、冬季、早春不可多得的中小型花卉[1-2]。

鈍葉酢漿草具有獨(dú)特的葉形花色，可盆栽種植[3]，作為年宵花供應(yīng)市場(chǎng)。盆栽可擺放于廣場(chǎng)、花壇、花臺(tái)或布置巖石園，鈍葉酢漿草是中國(guó)南方全部生育期可以在露地栽培的地被[4]，生長(zhǎng)迅速，覆蓋力強(qiáng)[5]。如今，鈍葉酢漿草已經(jīng)走進(jìn)各個(gè)園藝愛好者的視野并受到追捧[6]，目前只在網(wǎng)絡(luò)電商中出售種球和盆栽，鱗莖按照規(guī)格不同從2～50元不等，盆栽根據(jù)品種從15～100元不等，部分新品種能賣出數(shù)百元的價(jià)格。繁育困難，供不應(yīng)求，是其市場(chǎng)價(jià)格走高的主要因素。

目前僅有少量酢漿草專類玩家培育部分種內(nèi)雜交品種[7]，而對(duì)其相關(guān)研究少之又少?，F(xiàn)今，對(duì)于酢漿草屬組織培養(yǎng)的研究大部分集中在紫葉酢漿草(Oxalistriangularis)上[7-15]，另有研究者研究熔巖酢漿草(Oxalisspiralissubsp.vulcanicola)的組培快繁技術(shù)[16]，還有部分研究者研究山酢漿草(Oxalisacetosella)的組織培養(yǎng)體系[17]；對(duì)于鈍葉酢漿草的研究?jī)H僅停留在種群鑒別上。研究者發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的鈍葉酢漿草間存在生殖隔離[18-19]，解釋鈍葉酢漿草雜交苗培育的困難。而對(duì)于鈍葉酢漿草的組織培養(yǎng)仍沒有研究者涉足。

園藝師為了創(chuàng)造更多花色的品種，會(huì)對(duì)鈍葉酢漿草進(jìn)行雜交，但鈍葉酢漿草為異形花柱[2]，不易結(jié)實(shí)，部分品種存在生殖隔離[19]，種子是頑拗性種子，不耐失水，雜交種子采收后要立即播種，發(fā)芽率低，發(fā)芽不整齊[2]，在中國(guó)部分播種苗無法形成鱗莖直接枯萎死亡。生產(chǎn)中鈍葉酢漿草通常使用鱗莖繁殖?？墒氢g葉酢漿草收獲的鱗莖尺寸不均，不便標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，儲(chǔ)藏時(shí)易失水死亡。以上問題是鈍葉酢漿草批量生產(chǎn)和工廠化育苗的瓶頸。

為了建立鈍葉酢漿草通用性強(qiáng)，生長(zhǎng)繁殖速度快的組織培養(yǎng)體系，該試驗(yàn)以雜交鈍葉酢漿草的葉片和莖尖為外植體，在含有不同質(zhì)量濃度激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行組培研究。旨在獲得鈍葉酢漿草的完整繁殖體系，提高其種苗質(zhì)量，為鈍葉酢漿草的深入研究提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取購買于北京四環(huán)花木中心的鈍葉酢漿草‘鋰輝石’(Oxalisobtuse‘Kunzite’)、鈍葉酢漿草‘芬達(dá)’(Oxalisobtusa‘Fanta’)、鈍葉酢漿草‘大花’(Oxalisobtuse‘large form’)長(zhǎng)勢(shì)相近、發(fā)育正常的植株莖尖和葉片為試驗(yàn)材料。材料放置于北京農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)樓組培室內(nèi)培養(yǎng)，環(huán)境條件設(shè)置：光照14 h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx，溫度25 ℃±2 ℃，濕度50%～55%左右。

1.2 材料處理

選擇盛花期、無病蟲害的鈍葉酢漿草植株的葉片和莖尖為繁殖材料。將選取的莖尖和葉片用2%表面活性劑溶液浸泡2 min，流水沖洗40～60 min，75%酒精處理15 s。將葉片分為3組，分別用2%NaClO溶液浸泡5、10和15 min，無菌水沖洗2次，葉片切成大小0.5 cm2左右，莖尖切成大小0.5 cm，備用。

1.3 啟動(dòng)培養(yǎng)

試驗(yàn)以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在萘乙酸(NAA)質(zhì)量濃度保持不變的情況下，每增加0.5 mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)的質(zhì)量濃度設(shè)置一組培養(yǎng)基，設(shè)置6個(gè)試驗(yàn)組(表1)。將經(jīng)過消毒處理的葉片接種到6組培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)基接種9片葉，設(shè)置5次重復(fù)。將經(jīng)過消毒處理的莖尖接種到6組培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)基接種6段莖尖，設(shè)置5次重復(fù)。將完成接種的培養(yǎng)基放入組培室內(nèi)暗培養(yǎng)，28 d后轉(zhuǎn)為光培養(yǎng)。每隔7 d觀察記錄外植體、愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)及出愈率，選出最佳外植體、啟動(dòng)培養(yǎng)基和消毒時(shí)間。

表1 不同質(zhì)量濃度激素的鈍葉酢漿草初代培養(yǎng)基的配制Tab.1 Preparation of Oxalis obtusa primary medium with different hormone concentrations

1.4 繼代培養(yǎng)

試驗(yàn)設(shè)置NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L和0.2 mg/L兩大組，每一大組內(nèi)設(shè)置6-BA 1.0、1.5和2.0 mg/L 3組，共計(jì)6組(表2)。經(jīng)過初代培養(yǎng)的外植體長(zhǎng)出芽后，將其分別接種到6組繼代培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種5個(gè)芽，設(shè)置5次重復(fù)，在繼代培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。每隔7 d觀察記錄芽的生長(zhǎng)情況，選出最佳繼代培養(yǎng)基，待芽生長(zhǎng)到一定規(guī)格后移入生根培養(yǎng)基中。

表2 不同質(zhì)量濃度激素的鈍葉酢漿草繼代培養(yǎng)基的配制Tab.2 Preparation of Oxalis obtusa subculture medium with different concentrations of hormones

1.5 生根培養(yǎng)

試驗(yàn)以1/2 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)置6-BA質(zhì)量濃度為0 mg/L和0.5 mg/L兩大組，每一大組內(nèi)設(shè)置NAA 0.05、0.10和0.15 mg/L，共計(jì)6組(表3)。將生長(zhǎng)達(dá)到5 cm的芽移入6組生根培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿接種5個(gè)芽，設(shè)置5次重復(fù)，觀察植株變化情況，待根系生長(zhǎng)至一定長(zhǎng)度后進(jìn)行煉苗。

表3 不同質(zhì)量濃度激素的鈍葉酢漿草生根培養(yǎng)基的配制Tab.3 Preparation of root medium Oxalis obtusa with different concentrations of hormones

1.6 煉苗與移栽

組培苗根系長(zhǎng)度達(dá)到5 cm以上，打開培養(yǎng)瓶進(jìn)行煉苗。首先在溫室內(nèi)半陰處輕輕旋松瓶蓋2 d，保證培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)外的氣體交換，然后完全開蓋2 d，在自然光下開瓶煉苗3 d。最后將泥炭、珍珠巖和蛭石按照2∶1∶1比例混合作為基質(zhì)，種植組培苗，并逐步轉(zhuǎn)入日常管理。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適消毒時(shí)間的選擇

將3種鈍葉酢漿草的外植體暗培養(yǎng)28 d后，統(tǒng)計(jì)最適消毒時(shí)間，見表4和圖1及圖2。‘大花’鈍葉酢漿草葉片是3個(gè)品種中表現(xiàn)最好的，其余兩個(gè)品種存活率低不做統(tǒng)計(jì)。用75%酒精和2%NaClO溶液浸泡10 min的消毒方法最好，外植體成活率高達(dá)74.0%，且長(zhǎng)出大量愈傷組織，有利于后期植株生長(zhǎng)。用75%酒精和2%NaClO溶液浸泡15 min的消毒方法外植體無菌率最高，達(dá)80.0%，但成活的外植體沒有長(zhǎng)出愈傷組織，且褐化、黃化嚴(yán)重，失去生命力，如圖1所示。而用75%酒精和2%NaClO溶液浸泡5 min的消毒方法外植體損傷最小，但污染率最高，不利于后期無菌操作，如圖2所示。

表4 不同消毒方法對(duì)‘大花’鈍葉酢漿草外植體的影響Tab.4 Effects of different disinfection methods on explants of Oxalis obtuse ‘large form’

2.2 最適啟動(dòng)培養(yǎng)基的選擇及最適外植體的選取

3種鈍葉酢漿草的外植體暗培養(yǎng)28 d后，轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)7 d，并對(duì)生長(zhǎng)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。不同質(zhì)量濃度激素配比導(dǎo)致各培養(yǎng)基外植體生長(zhǎng)情況不同，其中‘大花’鈍葉酢漿草的表現(xiàn)最明顯，對(duì)其進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(表5)。A2到A5各組不同程度誘導(dǎo)出愈傷組織，其中A4組愈傷組織飽滿，呈松散狀，表面透明，有綠色的芽點(diǎn)出現(xiàn)，生長(zhǎng)良好，利于分化，最為優(yōu)秀。A1組外植體萎縮，沒有分化出愈傷組織。A2組外植體褪色，愈傷組織排列緊密，半透明，呈白色，沒有芽點(diǎn)。A3組愈傷組織排列緊密，呈淺黃色，分化趨勢(shì)很慢。A5組愈傷組織淺綠色，沒有芽點(diǎn)，松散程度介于A3組、A4組之間。A6組外植體飽滿，但沒有分化出愈傷組織和芽點(diǎn)。6組莖尖全部成活，狀態(tài)飽滿，但污染嚴(yán)重。通過比較，A4組長(zhǎng)勢(shì)最快，莖尖中心長(zhǎng)出新葉，新葉葉柄伸長(zhǎng)，葉片展開，生長(zhǎng)良好，最為優(yōu)秀。A2組和A5組莖尖生長(zhǎng)緩慢。A3組莖尖長(zhǎng)出新葉，但新葉仍皺縮。A1組和A6組的莖尖沒有生長(zhǎng)。通過比較，A4組的鈍葉酢漿草愈傷組織和莖尖生長(zhǎng)最好，如圖3所示。A1組和A6組的莖尖沒有生長(zhǎng)。采用MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+30 g/L瓊脂的配方為鈍葉酢漿草最適啟動(dòng)培養(yǎng)基。培養(yǎng)時(shí)，莖尖的污染狀況較葉片更嚴(yán)重。鈍葉酢漿草莖尖不適宜作為外植體。而鈍葉酢漿草葉片消毒效果好，是啟動(dòng)培養(yǎng)的最佳外植體。

表5 不同啟動(dòng)培養(yǎng)基對(duì)‘大花’鈍葉酢漿草外植體的影響Tab.5 Effects of different primary medium on explants of Oxalis obtuse ‘large form’

2.3 不同品種在最適啟動(dòng)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

暗培養(yǎng)28 d后，統(tǒng)計(jì)3種鈍葉酢漿草愈傷組織的分化情況。不同品種在同種激素配比下外植體出愈率不同(表6)。通過比較，葉片最厚質(zhì)地最硬的‘大花’鈍葉酢漿草出愈率最高，在A4組中高達(dá)66.7%。‘鋰輝石’鈍葉酢漿草葉片較厚，質(zhì)地較軟，在A4組出愈率為51.8%，而葉片較薄質(zhì)地最軟的‘芬達(dá)’鈍葉酢漿草出愈率較低，只有22.2%。3個(gè)品種的培養(yǎng)狀態(tài)如圖4所示。在激素配比相同時(shí)，鈍葉酢漿草葉片越厚、質(zhì)地越硬，更易分化出愈傷組織，更適宜植物組織培養(yǎng)。

表6 3個(gè)品種鈍葉酢漿草在同種激素配比下外植體出愈率Tab.6 The germination rate of 3 varieties of Oxalis obtusa explants under the same hormone concentration

2.4 最適繼代培養(yǎng)基的選擇

在NAA為0.1 mg/L時(shí)，隨著6-BA質(zhì)量濃度升高，鈍葉酢漿草芽的生長(zhǎng)速度加快，分枝增加(表7)。其中，B3組芽生長(zhǎng)速度最快，長(zhǎng)出的分枝較多，同時(shí)芽高度適中，莖直立健壯，長(zhǎng)勢(shì)最優(yōu)。B1組芽生長(zhǎng)較快但分枝極少。B2組芽生長(zhǎng)較快，芽分支少，莖直立。而當(dāng)NAA為0.2 mg/L時(shí)，隨著6-BA質(zhì)量濃度升高，鈍葉酢漿草芽的生長(zhǎng)速度略微加快，但分枝形態(tài)彎曲無法利用。B4組芽生長(zhǎng)很慢，分枝少，莖高而扭曲。B5組芽生長(zhǎng)較慢，分枝少，莖彎曲。B6組生長(zhǎng)較快，芽分枝較多，但形態(tài)扭曲難以分離。MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+30 g/L蔗糖+30 g/L瓊脂，是培養(yǎng)鈍葉酢漿草的最適繼代培養(yǎng)基。

表7 不同繼代培養(yǎng)基對(duì)鈍葉酢漿草外植體的影響Tab.7 Effects of different subculture medium on explants of Oxalis obtusa

2.5 最適生根培養(yǎng)基的選擇

在6-BA質(zhì)量濃度為0.0 mg/L時(shí)，隨著NAA質(zhì)量濃度升高，鈍葉酢漿草根的生長(zhǎng)速度加快(表8)。其中C2組根密而粗壯，葉綠色，植株健壯，長(zhǎng)勢(shì)最好。C1組植株較弱，根密且細(xì)弱，葉淺綠。C3組植株較細(xì)弱，根稀而粗壯，葉淺綠。

在6-BA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時(shí)，隨著NAA質(zhì)量濃度升高，鈍葉酢漿草根的生長(zhǎng)情況被明顯抑制，植株?duì)顟B(tài)差。其中C4組植株細(xì)弱，根系稀疏，葉黃。C5組植株很弱，只有零星根系長(zhǎng)出，葉黃。C6組沒有分化出根系，葉黃。采用1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+30 g/L蔗糖+30 g/L瓊脂的培養(yǎng)基是鈍葉酢漿草的最適生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)得到的苗在煉苗時(shí)損失少，移栽容易恢復(fù)，葉片深綠且生長(zhǎng)快，如圖5所示。

表8 不同生根培養(yǎng)基對(duì)鈍葉酢漿草無菌苗的影響Tab.8 Effects of different root medium on sterile seedlings of Oxalis obtuse

3 討 論

鈍葉酢漿草組織培養(yǎng)的外植體選擇很重要，一般選用葉片或莖尖，其中莖尖消毒不便、易污染[17]，而葉片消毒操作簡(jiǎn)便，污染率低，因此鈍葉酢漿草組織培養(yǎng)的最適外植體是葉片。胡國(guó)富等[12]確定培養(yǎng)三角紫葉酢漿草的最適外植體為葉片。陳芬等[16]以熔巖酢漿草葉片為外植體研究得出組培快繁技術(shù)。該試驗(yàn)使用葉片為外植體進(jìn)行培養(yǎng)與前人研究結(jié)果一致。

該試驗(yàn)確定鈍葉酢漿草葉片的最適消毒方法，75%酒精浸泡15 s后用2%NaClO溶液浸泡10 min的消毒效果最好，外植體成活率最高。消毒時(shí)間短，外植體不易損傷，但無法殺死雜菌，通常長(zhǎng)出乳白色或淡黃色菌落。其中為了使葉片更清潔，用流水沖洗葉片時(shí)間應(yīng)加長(zhǎng)到40 min至60 min，沖洗時(shí)水流適中，防止葉片損傷。在選取的3個(gè)品種中，葉片的質(zhì)地越硬出愈率越高。葉片最硬最厚的‘大花’葉片平整、絨毛少，能緊密貼合培養(yǎng)基，在各組培養(yǎng)基中發(fā)芽率最高，長(zhǎng)勢(shì)最好。葉片最薄、質(zhì)地最軟的‘芬達(dá)’在各組培養(yǎng)基的出愈率都不理想。消毒時(shí)間長(zhǎng)，薄葉片的品種易受傷害，受害葉片背面呈海綿狀，質(zhì)地軟、易碎，操作困難，出愈率低，部分葉片褪色，培養(yǎng)時(shí)易黃化、褐化。而厚葉片的品種在消毒后受到的損傷小，便于劃傷培養(yǎng)。鈍葉酢漿草葉片厚、質(zhì)地硬的品種更適宜植物組織培養(yǎng)。

不同質(zhì)量濃度的激素配比導(dǎo)致外植體在啟動(dòng)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)過程中產(chǎn)生不同的生長(zhǎng)情況。啟動(dòng)培養(yǎng)中，NAA和6-BA對(duì)鈍葉酢漿草葉片愈傷組織的形成起到關(guān)鍵作用。高貴珍等[20]在紫葉酢漿草組織培養(yǎng)中確定啟動(dòng)培養(yǎng)基激素配比為6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，外植體接種10 d后即可產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)率83.3%。而在該試驗(yàn)當(dāng)NAA質(zhì)量濃度保持不變時(shí)，隨著6-BA的質(zhì)量濃度漸漸升高，其對(duì)鈍葉酢漿草外植體分化趨勢(shì)越來越強(qiáng)。當(dāng)6-BA的質(zhì)量濃度超過臨界值2.0 mg/L時(shí)，6-BA質(zhì)量濃度逐漸升高，鈍葉酢漿草莖愈傷組織排列緊密，不利出芽。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度2.5 mg/L，NAA質(zhì)量濃度0.2 mg/L時(shí)，葉片不會(huì)長(zhǎng)出愈傷組織，莖尖也不會(huì)生長(zhǎng)。該試驗(yàn)將啟動(dòng)培養(yǎng)基激素配比調(diào)整為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。繼代培養(yǎng)中，NAA誘導(dǎo)鈍葉酢漿草植株長(zhǎng)出不定根，6-BA促進(jìn)莖葉伸長(zhǎng)和誘導(dǎo)側(cè)芽生成。蔡麗瓊等[21]、張興桃[22]等在紫葉酢漿草組織培養(yǎng)中確定繼代培養(yǎng)基激素配比為NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，不定芽增殖系數(shù)最高，達(dá)3.46±0.61。而該試驗(yàn)過程中，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度0.1 mg/L時(shí)，鈍葉酢漿草再生芽生長(zhǎng)速度隨著6-BA質(zhì)量濃度增加而加快，形態(tài)直立健壯。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度0.2 mg/L時(shí)，再生芽生長(zhǎng)速度隨著6-BA質(zhì)量濃度增加而加快，生長(zhǎng)旺盛但形態(tài)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的扭曲；可見只有二者處于合適的比例時(shí)，外植體才能快速大量產(chǎn)生愈傷組織，并加以誘導(dǎo)產(chǎn)生可用的再生芽，因此該試驗(yàn)最佳繼代培養(yǎng)為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。生根培養(yǎng)中，王利[23]在紫葉酢漿草組織培養(yǎng)中確定生根培養(yǎng)基激素配比為NAA 0.2 mg/L時(shí)，叢生芽發(fā)生效果好，葉片寬大，葉柄粗壯，根系健壯，培養(yǎng)全過程只要40 d，成活率最高達(dá)96%。而該試驗(yàn)培養(yǎng)基同時(shí)加入6-BA和NAA時(shí)，不論NAA為何種質(zhì)量濃度鈍葉酢漿草無菌苗的生長(zhǎng)狀況都不好。當(dāng)培養(yǎng)基中只有NAA時(shí)，隨著NAA質(zhì)量濃度的升高，植株根系生長(zhǎng)加快，NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時(shí)，出根率59.2%，得到的無菌苗根密而粗壯，便于移栽。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度超過臨界值0.1 mg/L時(shí)，NAA質(zhì)量濃度逐漸升高，鈍葉酢漿草根系數(shù)量減少，植株長(zhǎng)勢(shì)變差，因此該試驗(yàn)將激素NAA確定為0.1 mg/L。

為了提高移栽成活率，讓鈍葉酢漿草組培苗更好生長(zhǎng)，需要先在溫室半陰處適應(yīng)，同時(shí)因?yàn)殁g葉酢漿草有遇高溫休眠的習(xí)性，組培苗移栽后應(yīng)盡量處于18～25 ℃的環(huán)境內(nèi)，防止環(huán)境溫度過高引起組培苗落葉休眠死亡。由于組培瓶?jī)?nèi)濕度大，移栽后的組培苗地上部分仍然要保持一定濕度，組培苗定植后的根系尚未完全適應(yīng)基質(zhì)，所以應(yīng)保持基質(zhì)濕潤(rùn)，防止基質(zhì)過澇爛根。并隨日常管理逐漸降低濕度，直至與溫室內(nèi)一致。此外需要注意的是，組培苗根部的培養(yǎng)基要清理干凈，否則會(huì)滋生大量細(xì)菌真菌引起根部腐爛。

該試驗(yàn)以鈍葉酢漿草葉片為外植體，檢測(cè)葉片的消毒時(shí)間，篩選啟動(dòng)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，最終獲得大量鈍葉酢漿草組培苗，確立鈍葉酢漿草組織培養(yǎng)技術(shù)體系，為批量化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。