梁曉靜 朱昌叁 李開(kāi)祥 安家成 王鵬良

摘 要：? 為了解香樟基因密碼子偏好性，該文以NCBI網(wǎng)站中香樟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為材料，利用生物信息學(xué)手段評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量，選取高質(zhì)量數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄組，去除低質(zhì)量序列，組裝轉(zhuǎn)錄組，預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)，再利用自編perl腳本提取以AUG開(kāi)頭的基因序列37 Mb序列34 931個(gè)基因，進(jìn)一步利用CodonW分析基因密碼子偏好性。結(jié)果表明：GC含量的變化范圍為0.273～0.742，均值為0.452;ENC的范圍為26.29～61.00，均值為52.76;CAI的范圍為0.064～0.401，均值為0.199;RSCU值大于1的密碼子數(shù)目為27個(gè)，其中以U或A結(jié)尾的有22個(gè);中性分析表明，小部分基因在對(duì)角線上，大多數(shù)基因偏離對(duì)角線;ENC-plot分析表明小部分基因在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，大多數(shù)基因偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線。上述研究結(jié)果表明，香樟基因的密碼子偏好性比較弱，密碼子常以A/U結(jié)尾;突變和選擇兩者都在密碼子偏好中起作用，而選擇作用更大;最終確定了GUU、CAG、GAA、UCU、GCU、GGU為最優(yōu)密碼子，通過(guò)對(duì)目標(biāo)基因密碼子的校正，提高表達(dá)效率，從而為利用基因工程技術(shù)改良香樟重要性狀奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 香樟， 轉(zhuǎn)錄組， 基因， 密碼子， 偏好性

中圖分類號(hào)：? Q945.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2021）12-2077-07

收稿日期：? 2020-07-22

基金項(xiàng)目：? 自治區(qū)主席科技資金項(xiàng)目（1517-06）;第八批廣西特聘專家專項(xiàng);廣西林科院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（林科201806號(hào)）;廣西重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（19-B-04-01）? [Supported by the Scientific Program of Chairman in Guangxi （1517-06）; the Eighth Batch Guangxi Special Expert Program; Basic Research Fund of Guangxi Forestry Research Institute （LinKe 201806）; Open Project of Guangxi Key Laboratory （19-B-04-01）]。

作者簡(jiǎn)介： 梁曉靜（1983-），碩士，高級(jí)工程師，主要從事經(jīng)濟(jì)林栽培育種研究，（E-mail）liangxj2013@126.com。

通信作者：? 王鵬良，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事植物遺傳育種研究，（Email）pengliang_wang@163.com。

Codon bias of transcriptomic genes? in Cinnamomum camphora

LIANG Xiaojing1， ZHU Changsan1， LI Kaixiang1， AN Jiacheng1， WANG Pengliang2*

（ 1. Guangxi Forestry Research Institute， Guangxi Key Laboratory for Cultivation and Utilization of Special Non-Timber Forest Crops， Engineering and Technology Research Center for Anise and Cinnamon of State Forestry Administration， Guangxi Engineering and Technology Research Center for Woody Spices， Nanning 530002， China; 2. Beibu Gulf University， Qinzhou 535011， Guangxi， China ）

Abstract：? In order to understand the genes codon bias of transcriptome in Cinnamomum camphora， all transcriptome data of C. camphora were downloaded， screened against their quality. The screened data were assembled and annotated in gene structure after low-quality reads were deleted. Then 37 Mb gene sequences initiated with AUG were extracted by perl script with 34 931 genes. The codon bias was analyzed using CodonW software. The results were as follows： GC content ranged from 0.273 to 0.742 with the average of 0.452; ENC ranged from 26.29 to 61.00 with the average of 52.76; CAI ranged from 0.064 to 0.401 with the average of 0.199; There were 27 genes whose RSCU were greater than 1， of which 22 genes ended with U or A; Neutral plot analysis indicated that a great many genes were not on the line and ENC-plot showed the similar results. The above results elucidate that the gene codon bias of transcriptome was weak， and most ended with U or A; Selection played more important role than mutation in codon bias; Finally， GUU， CAG， GAA， UCU， GCU and GGU were taken as the optimal codons. This will provide a solid foundation for improving traits of C. camphora via the codon revision of the targeted genes.

Key words： Cinnamomum camphora， transcriptome， genes， codon， bias

香樟（Cinnamomum camphora）是樟科樟屬的一種常綠大喬木，為我國(guó)國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，廣泛分布于我國(guó)南方及西南各?。ㄖ袊?guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1982）。香樟的木材是良好的建筑用材，其根、枝葉、木材和種子均可提取樟腦和樟油，用途十分廣泛，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

香樟群體及個(gè)體間均存在較大遺傳變異。根據(jù)樟油化學(xué)成分差異，香樟可分為本樟、芳樟和油樟（中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1982）;從外部表型上看，材用和油用樟樹(shù)木材構(gòu)造存在差異（王軍鋒等，2019），不同化學(xué)型油用樟樹(shù)葉片解剖結(jié)構(gòu)和抗旱性也存在差異（王坤等，2019），從內(nèi)部遺傳物質(zhì)上看，等位基因也存在較大差異（劉爽，2019）。豐富的遺傳變異為香樟的定向遺傳改良提供了良好的資源。遺傳改良通常利用雜交等傳統(tǒng)的方法開(kāi)展，然而這些方法存在周期長(zhǎng)、成本高、盲目性大等不足。而分子育種能有效克服這些缺點(diǎn)成為現(xiàn)代育種的重要手段。

盡管香樟的分子研究起步較遲，但已有一些報(bào)道。Liu et al. （2015）利用同源克隆的方法克隆了香樟CcBBM，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)化驗(yàn)證;Chen et al. （2018）利用轉(zhuǎn)錄組對(duì)香樟萜類生物合成基因開(kāi)展了鑒定分析;另外，研究人員對(duì)香樟不同化學(xué)成分合作途徑的關(guān)鍵基因CcHMGRs（鄭漢等，2020a）、CcPMK（鄭漢等，2020b）及NBS-LRR類抗病基因家族開(kāi)展克隆和部分功能分析的工作（鄭永杰等，2018）;同時(shí)施雪萍（2009）和陳甘明（2014）先后建立了香樟體細(xì)胞再生體系并成功將Barnase、PaFT、CBF3和DREB1等基因轉(zhuǎn)入香樟，為香樟不同成分的合成、抗逆機(jī)理探索和遺傳改良奠定基礎(chǔ)。基因工程育種是分子育種的重要方法之一，具有周期短、效率高、目標(biāo)明確等優(yōu)點(diǎn)（王關(guān)林和方宏筠，2014）。密碼子指導(dǎo)氨基酸的合成（Krebs et al.， 2018）。不同的密碼子對(duì)基因的表達(dá)和功能產(chǎn)生較大影響（Hershberg & Petrov， 2008; Zhou et al.， 2016）。不同物種密碼子偏好性存在較大差異（陸育生等，2018），了解香樟基因的密碼子偏好性，對(duì)利用基因工程技術(shù)培育香樟新品種具有十分重要的作用。因此，本文分析香樟轉(zhuǎn)錄組基因密碼子偏好性，確定最優(yōu)密碼子，從而為利用基因工程改良香樟奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI網(wǎng)站中下載6個(gè)SRR6436155、SRR6436156、SRR8316438、SRR6436010、SRR6436011、SRR6374671香樟轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果。本文利用FastQC檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組的序列質(zhì)量，篩選數(shù)據(jù)質(zhì)量較高的轉(zhuǎn)錄組為材料，再利用Trimmomatic修剪去除低質(zhì)量的序列和接頭。在此基礎(chǔ)上利用Trinity對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行組裝，利用TransDecoder預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)。提取以AUG開(kāi)頭的基因用于本文的后續(xù)分析。

1.2 數(shù)據(jù)分析

1.2.1 密碼子偏好參數(shù)估計(jì) 以所選的編碼蛋白基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采用CodonW 1.4.2軟件分析密碼子偏好性的參數(shù)：有效密碼子數(shù)目（ENC）、密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）、密碼子偏好性指數(shù)（CBI）、最優(yōu)密碼子使用頻率（Fop）、基因表達(dá)的蛋白質(zhì)疏水性（Gravy）和芳香族氨基酸的頻率（Aromo）及密碼子不同位置堿基的比例（GC1、GC2和GC3分別代表第一位、第二位和第三位密碼子的GC含量，GC3s表示第三位同義密碼子的GC含量）。

1.2.2 中性繪圖分析 為了初步摸索對(duì)密碼子偏好性的影響因素，中性繪圖根據(jù)GC1和GC2均值記為GC12，其作為縱坐標(biāo)，GC3作為橫坐標(biāo)，用基因散點(diǎn)圖的方式進(jìn)行作圖。根據(jù)基因所在位置與對(duì)角線的關(guān)系從而判斷影響基因密碼子偏好性的因素。

1.2.3 ENC-plot繪圖 為進(jìn)一步了解造成密碼子偏好的原因，本文以ENC為縱坐標(biāo)，以GC3s為橫坐標(biāo)建立坐標(biāo)系，根據(jù)基因坐落的位置作散點(diǎn)圖。再利用方程添加其理論標(biāo)準(zhǔn)曲線ENCexp=2+GC3s+29GC3s2+（1-GC3s）2 ，并計(jì)算ENCRatio=ENCexp-ENCobsENCexp。根據(jù)散點(diǎn)圖及ENC比值的結(jié)果推斷造成密碼子偏好的原因。

1.2.4 最佳密碼子確定 為了確定最優(yōu)密碼子，本文以CAI密碼子偏好性參數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)參試基因進(jìn)行排序，分別從高低兩端取總數(shù)的1%建立高表達(dá)庫(kù)和低表達(dá)庫(kù)，并以高表達(dá)庫(kù)的RSCU與低表達(dá)庫(kù)的對(duì)應(yīng)的RSCU的差值為ΔRSCU，以ΔRSCU大于0.08且RSCU大于1的密碼子為最優(yōu)密碼子。

2 結(jié)果與分析

2.1 香樟轉(zhuǎn)錄組選取

為了準(zhǔn)確分析香樟密碼子偏好性，本文從NCBI中下載了6個(gè)香樟轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果。但由于許多轉(zhuǎn)錄組沒(méi)有明確注明轉(zhuǎn)錄組的組織，或者對(duì)轉(zhuǎn)錄測(cè)序質(zhì)量比較差的結(jié)果進(jìn)行剔除，最后只剩下SRR6436155一個(gè)轉(zhuǎn)錄組用作本文的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)量為9.7 G。利用Trinity組裝轉(zhuǎn)錄組后得到305 Mb序列，利用cd-hit-est命令以默認(rèn)參數(shù)進(jìn)一步延伸得到229 Mb。在此基礎(chǔ)上，利用TransDecoder將轉(zhuǎn)錄組序列與Swissprot和pfam-A數(shù)據(jù)庫(kù)同源比對(duì)后得到54 Mb數(shù)據(jù)。利用自編perl腳本提取以AUG開(kāi)頭的37 Mb基因序列用于后續(xù)分析。

2.2 密碼子偏好性參數(shù)

本文利用CodonW軟件（https：//sourceforge.net/projects/codonw/）計(jì)算所有參試基因密碼子偏好性參數(shù)。由表1可知，密碼子不同位置堿基的GC含量差異較大，第一位、第二位和第三位密碼子GC含量的變化范圍分別為0.245～0.913、0.179～0.858和0.108～0.939，均值分別為0.511、0.408和0.434;總GC含量的變化范圍為0.273～0.742，均值為0.452; CAI的范圍為0.064～0.401，均值為0.199;CBI的范圍為-0.513～0.364，均值為-0.056;Fop的范圍為0.153～0.634，均值為0.384;Gravy的范圍為-2.747～1.436，均值為-0.259;其氨基酸長(zhǎng)度變化范圍86～476 5，均值為366;Aromo的變化范圍為0.000～0.324，均值為0.085。ENC的范圍為26.29～61.00，均值為52.76，在34 931基因中，有80個(gè)基因的ENC小于35（Jiang et al.， 2008），其余基因的ENC均大于35，這說(shuō)明香樟轉(zhuǎn)錄組中只有極少數(shù)基因偏好性較強(qiáng)，絕大多數(shù)基因的偏好性較弱，甚至有些基因沒(méi)有密碼子偏好性。

密碼子偏好性參數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果（表2）表明，GC1、GC2、GC3s與其余參數(shù)都呈極顯著相關(guān);GC3除與Gravy不相關(guān)外，與其他參數(shù)均顯著相關(guān)。上述說(shuō)明基因的堿基組成對(duì)密碼子偏好性參數(shù)存在一定影響。基因長(zhǎng)度（N）與基因不同位置的堿基含量極顯著相關(guān)，GC1、GC2及GC3的相關(guān)系數(shù)從0.145到-0.103，說(shuō)明基因越長(zhǎng)，GC1越高，GC3越低。基因長(zhǎng)度與CAI無(wú)顯著相關(guān);盡管基因長(zhǎng)度與密碼子偏好性參數(shù)CBI、Fop、ENC為極顯著相關(guān)，但其相關(guān)系數(shù)極低，說(shuō)明基因長(zhǎng)度對(duì)密碼子偏好影響不大。

RSCU分析結(jié)果（表3）表明，RSCU值大于1的密碼子數(shù)目為27個(gè)，其中以U結(jié)尾的有14個(gè)，以A結(jié)尾的有8個(gè)，以G結(jié)尾的有5個(gè);以A或U結(jié)尾的密碼子占81.48%。

2.3 中性繪圖

香樟葉片轉(zhuǎn)錄組基因中性繪圖結(jié)果（圖1）表明，GC12的變化范圍為0.271～0.759，GC3變化范圍為0.108～0.939。圖1中代表基因的點(diǎn)有一些落在對(duì)角線上，有更多的點(diǎn)偏離對(duì)角線，GC12與GC3的相關(guān)性不顯著。上述結(jié)果綜合表明香樟轉(zhuǎn)錄組基因密碼子偏好性同時(shí)受到突變和選擇的作用。

2.4 ENC-plot繪圖

以ENC作為y軸，以GC3s作為x軸，開(kāi)展ENC-plot繪圖。將參試基因都布置于該坐標(biāo)系，GC3s分布于0.077～0.937之間，代表基因的點(diǎn)有的著落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的上方，有的著落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的下方及另外一部分在標(biāo)準(zhǔn)曲線上（圖2）。為了進(jìn)一步分析基因分布的具體情況，本文分析了ENC比值的頻率分布（表4），32%的基因分布于-0.05～0.05之間，54.99%的基因分布于0.05～0.15之間，1.66%分布于-0.15～-0.05之間，9.62%分布于0.15～0.25之間，1.67%分布于0.25～0.5之間。說(shuō)明突變?cè)谙阏寥~片轉(zhuǎn)錄組基因偏好性形成過(guò)程中起重要作用，而選擇的作用更大。

2.5 最優(yōu)密碼子

按照基因密碼子偏好性參數(shù)CAI數(shù)值大小進(jìn)行排序，從兩端分別取1%的基因分別建立高表達(dá)庫(kù)和低表達(dá)庫(kù)，再分別計(jì)算兩個(gè)庫(kù)的RSCU，進(jìn)一步計(jì)算ΔRSCU。64個(gè)密碼子中，有25個(gè)密碼子的ΔRSCU大于0.08，其中以G結(jié)尾的有3個(gè)，以C結(jié)尾的有15個(gè)，以A結(jié)尾的有2個(gè)，以U結(jié)尾的有5個(gè)。結(jié)合表3中RSCU大于1的高頻密碼子與表5中標(biāo)星號(hào)的高表達(dá)密碼子，從而確定最優(yōu)密碼子。最終確定香樟葉片轉(zhuǎn)錄組基因中有6個(gè)最優(yōu)密碼子分別為GUU、CAG、GAA、UCU、GCU、GGU，其中5個(gè)密碼子以A或U結(jié)尾，另外1個(gè)以G結(jié)尾。

3 討論與結(jié)論

本文以測(cè)序質(zhì)量較高轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為材料研究香樟密碼子偏好性。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝、 延伸去除冗余序列的基礎(chǔ)上，利用TrasnsDecoder結(jié)合Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)和pfam-A數(shù)據(jù)庫(kù)的同源搜索大大提高了捕捉功能開(kāi)放閱讀框（opening reading framework， ORF）的敏感性和準(zhǔn)確性，同時(shí)確實(shí)也可能存在一些操縱子和嵌合體。然而在目前沒(méi)有香樟基因組的情況下，轉(zhuǎn)錄組基因密碼子分析仍然可以提供重要參考。

64種密碼子編碼20種氨基酸，其中3種終止密碼子，另有AUG和UGG分別只單獨(dú)編碼甲硫氨酸和色氨酸，其余59種密碼子編碼18種氨基酸（朱圣庚和徐長(zhǎng)發(fā)，2016;Krebs et al.，2018）。18種氨基酸中每種氨基酸至少有2種密碼子編碼，最多的有6種密碼子編碼（Nelson & Cox，2017），由于不同物種或同一物種不同基因組利用不同密碼子編碼同一氨基酸（王鵬良等，2018，2019;賴瑞聯(lián)等，2019），因此產(chǎn)生密碼子使用的偏好性。

香樟葉綠體基因組密碼子偏好性報(bào)道表明其密碼子偏好性較弱（秦政等，2018），本文中密碼子偏好性參數(shù)ENC均值為52.76，大于葉綠體基因組的ENC，表明香樟轉(zhuǎn)錄組基因密碼子偏好性比葉綠體更弱，也就是說(shuō)在同一密碼子中選擇任意密碼子對(duì)翻譯效率和蛋白功能影響較小。RSCU分析表明，香樟轉(zhuǎn)錄組基因密碼子仍然偏向以A或U結(jié)尾。這與橄欖轉(zhuǎn)錄組密碼子偏好性相似（賴瑞聯(lián)等，2019）。

密碼子偏好受堿基組成、選擇、突變、tRNA豐度、蛋白質(zhì)長(zhǎng)度、疏水性和脂肪族氨基酸含量的影響。ENC幾乎與所有的密碼子參數(shù)極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均低于0.1，與GC2呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.45;而另一密碼子偏好性參數(shù)CAI與不同位置GC含量相關(guān)，與氨基酸長(zhǎng)度相關(guān)性較小，均說(shuō)明密碼子偏好性與堿基組成有關(guān)，氨基酸長(zhǎng)度相關(guān)性小。CAI與CBI及Fop的緊密相關(guān)表明基因選擇高表達(dá)的密碼子。中性分析和ENC-plot分析表明突變?cè)诿艽a子偏好形成中起作用，而選擇在這個(gè)過(guò)程中起更大作用。本文篩選出6個(gè)香樟基因最優(yōu)密碼子分別為GUU、CAG、GAA、UCU、GCU、GGU。最優(yōu)密碼子的確定為利用基因工程技術(shù)改良香樟奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

目前，香樟的轉(zhuǎn)錄組研究、重要基因分子克隆正在迅猛開(kāi)展。香樟的遺傳轉(zhuǎn)化體系正逐步完善。施雪萍（2009）將GFP基因轉(zhuǎn)入香樟體細(xì)胞胚中，通過(guò)綠色熒光檢測(cè)、PCR檢測(cè)和Southern blotting檢測(cè)證實(shí)了GFP基因成功導(dǎo)入香樟基因組中，建立了相對(duì)完善的遺傳轉(zhuǎn)化體系;施雪萍（2009）將Barnase和PaFT基因分別轉(zhuǎn)入香樟基因組， 然而未對(duì)基因轉(zhuǎn)化的表型效應(yīng)進(jìn)行鑒定;王長(zhǎng)憲（2009）將沙冬青抗寒基因AmEBP1和AmGS轉(zhuǎn)入香樟基因組，并通過(guò)抗寒能力測(cè)定表明，轉(zhuǎn)基因植株的抗寒能力有所提高。然而施雪萍（2009）和王長(zhǎng)憲（2009）都沒(méi)有對(duì)目的基因的密碼子按照物種最優(yōu)密碼子進(jìn)行調(diào)整。Young & Purton （2016）報(bào)道了不適合的遺傳密碼子在一定程度上降低或阻止轉(zhuǎn)化目的基因的表達(dá)。按照密碼子偏好性結(jié)果對(duì)轉(zhuǎn)化目的基因進(jìn)行密碼子的修飾能夠大大促進(jìn)基因表達(dá)，提高目的基因的應(yīng)用效果。本研究的成果對(duì)利用基因工程技術(shù)改良香樟具有重要的指導(dǎo)意義。

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（責(zé)任編輯 李 莉）