陳廣棟，林錦雄，李秋英，冉亞妮，邱獻(xiàn)玲

（廣州艾蓓生物科技有限公司，廣東廣州 510850）

化妝品是在基質(zhì)（水或油性原料）中添加各種有效成分經(jīng)過(guò)多道生產(chǎn)工序制作而成的日用化學(xué)產(chǎn)品，常添加有水溶性高分子化合物、表面活性劑、防腐劑、香精等成分。因此，化妝品既能滿足消費(fèi)者對(duì)美的追求，在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、使用的過(guò)程中也很容易受到微生物的污染。在化妝品配方設(shè)計(jì)的過(guò)程中，防腐體系的構(gòu)建是其中重要的一環(huán)，化學(xué)成分防腐劑構(gòu)建的防腐體系雖然穩(wěn)定高效，但刺激性與致敏率也相對(duì)較高，植物成分組配的防腐劑、無(wú)添加防腐劑因其低刺激性與致敏率逐漸成為化妝品防腐體系構(gòu)建研究的熱門方向。在化妝品防腐體系構(gòu)建過(guò)程中，為保證化學(xué)成分防腐劑、植物成分組配的防腐劑或無(wú)添加防腐劑所構(gòu)建的化妝品防腐體系能夠滿足人們?nèi)粘Ｊ褂玫囊?，需要開(kāi)展微生物試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 化妝品樣品

試驗(yàn)用化妝品制作過(guò)程經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的無(wú)菌控制，防腐劑成分及含量明確。

1.1.2 防腐劑

化學(xué)成分防腐劑：羥苯甲酯、羥苯丙酯、苯氧乙醇、咪唑烷基脲；植物成分組配防腐劑：明串球菌/蘿卜根發(fā)酵產(chǎn)物濾液、秦椒果提取物/朝鮮白頭翁提取物/須松蘿提取物；無(wú)添加防腐劑：辛酰羥肟酸（抗氧化劑）、對(duì)羥基苯乙酮（保濕劑）、己二醇（保濕劑）、戊二醇（保濕劑）、辛甘醇（螯合劑）。

1.1.3 試驗(yàn)用菌種

細(xì)菌：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠色假單胞菌；酵母：白色假絲酵母；霉菌：黑曲霉。以上菌種均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.1.4 試驗(yàn)用儀器

YXQ-LS-100SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；1244 Ⅱ級(jí)生物安全柜，美國(guó)BioX科技有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BagMixer? 400拍打式無(wú)菌均質(zhì)器，法國(guó)INTERSCIENCE公司。

1.1.5 試驗(yàn)用培養(yǎng)基

大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）；D/E中和肉湯。

1.2 微生物試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)前增菌

細(xì)菌：從菌種斜面挑取并接種于TSA斜面上，在35 ℃下培養(yǎng)18～24 h；白色念珠菌：從菌種斜面挑取并接種SDA斜面上，在25 ℃下培養(yǎng)44～52 h；黑曲霉：從菌種斜面挑取并接種SDA斜面上，在25 ℃下培養(yǎng)6～10 d，或者更長(zhǎng)的時(shí)間，以便獲得足夠的孢子[1-2]。

1.2.2 試驗(yàn)接種菌液制備

用0.9% NaCl稀釋液洗脫細(xì)菌和白色念珠菌斜面并收集在相應(yīng)的試管中。用添加0.5%吐溫80的0.9% NaCl稀釋液洗脫黑曲霉斜面，孢子懸浮液用無(wú)菌工具去除菌絲。用比濁法和血球計(jì)數(shù)法將細(xì)菌菌液濃度調(diào)節(jié)至約5.0×108CFU/mL，霉菌、酵母菌菌液濃度調(diào)節(jié)至約5.0×107CFU/mL。用平板法計(jì)數(shù)，此活菌計(jì)數(shù)結(jié)果用于計(jì)算接種后樣品初始菌液濃度，用lg值在結(jié)果報(bào)告中表示。細(xì)菌和酵母菌懸液在2 h內(nèi)使用，貯存在2～8 ℃環(huán)境中24 h內(nèi)使用，黑曲霉孢子懸液可在2～8 ℃環(huán)境中保存7 d。

1.2.3 防腐體系構(gòu)建

如表1所示，構(gòu)建18個(gè)防腐體系，進(jìn)行微生物試驗(yàn)。

1.2.4 樣品接種

在50 g樣品中分別加入上述制備好的（混合）細(xì)菌初始菌懸液100 μL，確保（混合）細(xì)菌在樣品中的接種濃度為1.0×106CFU/mL；另取50 g樣品分別加入上述制備好的（混合）霉菌初始菌懸液100 μL，確保（混合）霉菌在樣品中的接種濃度均為1.0×105CFU/mL。將接種菌液后的樣品用攪拌棒充分?jǐn)嚢杌靹蚝笾糜?2.5 ℃保存。

表1 防腐體系構(gòu)建

1.2.5 取樣測(cè)定

在接種后的0 d、7 d、14 d、21 d和28 d取樣進(jìn)行測(cè)定，檢驗(yàn)方法按化妝品安全技術(shù)規(guī)范[3]進(jìn)行。

1.2.6 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

盥洗用品和香精協(xié)會(huì)（CTFA）的方法規(guī)定初始的（混合）細(xì)菌和（混合）霉菌的接種量分別為106CFU/g(mL)和105CFU/g(mL)，要求在第7 d時(shí)細(xì)菌減少99.9%，霉菌減少90%，并且在28 d內(nèi)菌數(shù)持續(xù)下降。美國(guó)藥典（USP）在CTFA評(píng)價(jià)方法的基礎(chǔ)上提出更為嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)：若單菌接種的3個(gè)平行試驗(yàn)中任何一種微生物數(shù)量的平均值在第7 d時(shí)下降到100 CFU/g(mL)以下，28 d全部為0，則視為效果優(yōu)良；通過(guò)試驗(yàn)若第7 d天時(shí)下降到1 000 CFU/g(mL)以下，則視為勉強(qiáng)通過(guò)；若混菌接種的任何一種微生物，任何一個(gè)平行樣達(dá)不到上述標(biāo)準(zhǔn)，也達(dá)不到CTFA的要求，防腐體系則評(píng)定為無(wú)效[4-6]。

2 結(jié)果與分析

18個(gè)防腐體系對(duì)（混合）細(xì)菌和（混合）霉菌的抑殺作用見(jiàn)表2和表3。由表2和表3可知，化學(xué)成分防腐劑與植物成分防腐劑構(gòu)建的化妝品防腐體系要優(yōu)于無(wú)添加防腐劑，且無(wú)添加防腐劑構(gòu)建的化妝品防腐體系沒(méi)有1例是優(yōu)良的，表現(xiàn)并不理想；表2中第7號(hào)、13號(hào)樣品以及表3中第14號(hào)、17號(hào)樣品，其含菌量在加菌后第28 d均大于21 d時(shí)的含菌量，說(shuō)明樣品中的防腐劑對(duì)添加的微生物只是起到一定的抑制作用，并不能有效殺滅，當(dāng)樣品的防腐效能下降或添加的微生物對(duì)樣品的防腐劑出現(xiàn)耐藥性時(shí)，添加的微生物又開(kāi)始進(jìn)行繁殖。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)微生物試驗(yàn)，對(duì)化妝品的防腐體系進(jìn)行了構(gòu)建與優(yōu)化，確認(rèn)了11種防腐劑在化妝品配方中的添加比例以及防腐效果：（1）由羥苯甲酯添加0.2%，羥苯丙酯添加0.2%，苯氧乙醇添加1%，明串球菌/蘿卜根發(fā)酵產(chǎn)物濾液添加3%～4%，秦椒果提取物/朝鮮白頭翁提取物/須松蘿提取物添加1%分別構(gòu)建的化妝品防腐體系防腐效果為優(yōu)良；（2）由苯氧乙醇添加0.8%，咪唑烷基脲添加0.6%，明串球菌/蘿卜根發(fā)酵產(chǎn)物濾液添加2%，秦椒果提取物/朝鮮白頭翁提取物/須松蘿提取物添加0.6%，辛酰羥肟酸/己二醇/辛甘醇添加1.5%，辛酰羥肟酸/戊二醇/辛甘醇添加1.5%分別構(gòu)建的化妝品防腐體系防腐效果為勉強(qiáng)通過(guò)，需要重新調(diào)整；（3）由羥苯丙酯添加0.1%，咪唑烷基脲添加0.2%，明串球菌/蘿卜根發(fā)酵產(chǎn)物濾液添加1%，秦椒果提取物/朝鮮白頭翁提取物/須松蘿提取物添加0.4%，對(duì)羥基苯乙酮/辛甘醇添加0.6%，己二醇/辛甘醇添加0.6%分別構(gòu)建的化妝品防腐體系防腐效果為無(wú)效，需要重新調(diào)整。通過(guò)化妝品微生物試驗(yàn)的測(cè)試，可以為化妝品配方中防腐劑防腐效果提供有效的數(shù)據(jù)參考。

表2 （混合）細(xì)菌一次加菌28 d微生物試驗(yàn)結(jié)果

表3 （混合）霉菌一次加菌28 d微生物試驗(yàn)結(jié)果