王 偉，李愛麗，宋 昕，李欣然，楊苗苗，徐瑞華，魏夢霞，韓文莉，雷玲玲，趙學(xué)科，孟超龍，胡守佳，程 錕，王盼盼，鐘 侃，胡景峰，郭貴周，王立東

早診、早防和早治是降低食管癌發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵[1]；闡明食管癌變多階段演進發(fā)生的分子機制，建立高危人群分子分型體系和關(guān)鍵檢測技術(shù)，是實現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵[2]；創(chuàng)立簡便高效的篩查技術(shù)，結(jié)合其他危險因素，篩選高危人群范圍，進一步通過色素內(nèi)鏡和黏膜病理活檢是目前實現(xiàn)無癥狀高危人群篩查和食管癌早期發(fā)現(xiàn)最有效的技術(shù)[3]；同時闡明環(huán)境—遺傳—基因互作對食管癌發(fā)生發(fā)展的影響[4]，揭示食管癌主要致病危險因素，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵分子機制及其與遺傳易感性的關(guān)系，是實現(xiàn)食管癌個體化早期預(yù)防的重要研究策略之一[5]。但是，目前對食管癌早期篩查關(guān)鍵技術(shù)指標尚無統(tǒng)一認識，更缺乏大規(guī)模高發(fā)區(qū)無癥狀人群篩查應(yīng)用的相關(guān)報道。本研究正是在前期發(fā)現(xiàn)的食管癌變相關(guān)分子機制所建立的分子分型體系的基礎(chǔ)上[6-14]，進行無癥狀高危人群篩查和早期發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原和自身抗體檢測技術(shù)研發(fā)，并進一步在河南食管癌高發(fā)區(qū)進行推廣應(yīng)用的初步研究結(jié)果?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

①選取2008年安陽市腫瘤醫(yī)院的350例食管癌患者和350例安陽地區(qū)的正常健康人。350例食管癌患者中，男性189例，女性161例，年齡34～78(56.1±3.4)歲；350例正常健康人中，男性173例，女性177例，年齡35～70(53.7±5.3)歲。食管癌患者經(jīng)組織病理學(xué)證實食管鱗癌，均未接受放療或化療；350例正常健康人均為正常體檢健康個體排除與腫瘤相關(guān)疾病、急性感染、過敏、自身免疫性疾病等。②選取來自安陽地區(qū)食管癌高發(fā)區(qū)的1 350例無癥狀個體進行血清自身抗體聯(lián)合檢測，其中男性594例，女性756例，年齡30～73(52.0±4.2)歲。同時對參與血清學(xué)檢測的無癥狀個體進行對應(yīng)的內(nèi)鏡檢查和黏膜病理活檢。③自2010年10月至2019年12月對林州高發(fā)地區(qū)現(xiàn)場研究基地，共計20 153例無癥狀個體進行血清自身抗體活檢篩查，其中男性9 976例，女性10 177例，年齡35～70(53.0±5.6)歲。對血清學(xué)檢測4種自身抗體中至少1種抗體陽性者進行內(nèi)鏡檢查和黏膜活檢。

1.2 實驗方法

1.2.1 血樣采集與保存所有納入研究的22 203例研究對象，每例抽取空腹靜脈血5mL至離心管中，室溫中靜置30 min，離心(2 000 r·min-1)，吸取上層血清分裝，每管分裝100 μL，-80 ℃冰箱儲存。

1.2.2 血清自身抗體檢測4種腫瘤相關(guān)抗原蛋白(cyclinB1、TGF-β1、Bcl-2、BRCA2)購于武漢艾美捷科技有限公司。將待檢測的血清樣本用樣品稀釋液按1∶500的比例進行稀釋，然后將稀釋后的血清樣本加入已包被抗原的48孔酶標板的反應(yīng)孔中，加樣每孔100 μL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1 h，洗滌液洗滌3次，每次洗滌3 min。已知陽性的血清為陽性對照,包被緩沖液為陰性對照。將辣根過氧化物酶標記的RecA蛋白用第二抗體稀釋液按1∶40 000的比例進行稀釋，加樣每孔100 μL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育50 min，洗滌液洗滌3次，每次3 min。加入TMB-過氧化氫尿素顯色液，每孔100 μL，置于37 ℃避光反應(yīng)15 min，然后向每個反應(yīng)孔中再加入50 μL終止液終止反應(yīng)，于20 min內(nèi)用酶標儀讀取OD450光密度值，并用空白對照調(diào)零。

1.2.3 血清自身抗體檢測結(jié)果判定以陰性對照孔所測OD值的平均數(shù)加兩個標準差(Mean+2SD)為截斷值(cut-off值)，反應(yīng)孔中OD值讀數(shù)大于等于截斷值的判斷為陽性，反應(yīng)孔中OD值讀數(shù)小于截斷值的判斷為陰性。

1.2.4 食管內(nèi)鏡檢查和黏膜活檢常規(guī)在食管中1/3段(距門齒30～32 cm)、下1/3段(食管、賁門交界線上2～3 cm)和賁門(齒狀線下2 cm) 各取1～2塊活檢組織，并在肉眼可見的病變處隨機取材，必要時進行食管黏膜碘染色和賁門黏膜美藍染色。在食管不染區(qū)和賁門染區(qū)取材，所有活檢組織均迅速置于95%乙醇內(nèi)固定。常規(guī)脫水后石蠟包埋切片，每張切片厚5 μm，做常規(guī)HE染色，核實組織病理學(xué)診斷。

1.2.5 病理組織學(xué)檢查根據(jù)細胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu),將食管上皮分為正常(normal,NOR)、基底細胞過度增生( basal cell hyperplasia,BCH)、不典型增生(dysplasia,DYS) 、鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)和其他腫瘤(other,OTH)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法配對資料比較和自身抗體檢查結(jié)果分析采用χ2檢驗。所有計算均使用SPSS 23.0進行，P<0.05被認為有效。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤相關(guān)自身抗體在食管癌患者中檢出的敏感性和特異性350例食管癌和350例正常人的血液自身抗體檢測分析結(jié)果顯示，cyclinB1、TGF-β1、Bcl-2、BRCA2這4種自身抗體在食管癌患者血清中陽性表達水平明顯高于正常人群。其中食管癌患者中TGF-β1 (46.00%)和Bcl-2 (52.00%)陽性表達率最高，相對于正常人分別升高了3倍(cyclinB1∶38.57% VS 12.57%)，2.3倍(Bcl-2：52% VS 22%)和2.5倍(TGF-β1∶46.00% VS 18.00%；BRCA2∶41.43% VS 16.57%)。提示4種自身抗體在食管癌患者和正常人血清中存在差異(表1)。同時，對4種不同腫瘤相關(guān)抗原進行了優(yōu)化組合，發(fā)現(xiàn)當4種腫瘤相關(guān)抗原聯(lián)合檢測時，食管癌患者陽性率是正常人的4倍，同時對食管癌診斷的靈敏度高達82.00%，特異性達到79.71%。結(jié)果表明，同時運用4種指標聯(lián)合檢測，對兩組人群具有較高的正確判定性和診斷價值，檢測效能達到最佳(表2)。

表1 4種血清自身抗體在食管鱗癌患者和正常人群中的表達 例(%)

表2 4種腫瘤相關(guān)抗原組合靈敏度和特異性

2.2 無癥狀人群血清自身抗體檢測聯(lián)合內(nèi)鏡檢查、黏膜病理活檢驗證結(jié)果對安陽食管癌高發(fā)區(qū)1 350例無癥狀人群進行4種血清自身抗體聯(lián)合檢測，性別、年齡分布見表3。有261例至少對一種指標顯示抗體陽性,陽性率19.33% (261/1 350)。進一步對226例自身抗體陽性高危人群進行內(nèi)鏡下檢查(35例自身抗體陽性者未能按時進行胃鏡檢查)，其中發(fā)現(xiàn)NOR(49例，21.68%)、BCH(52例，23.01%)、DYS(85例，37.61%)、SCC(36例，15.93%)和OTH(4例，1.77%)；隨食管癌前病變程度的加重，至少一種抗體陽性檢出率呈逐漸遞增趨勢,而且出現(xiàn)多種自身抗體陽性，226例自身抗體陽性率對應(yīng)內(nèi)鏡檢查結(jié)果見表4。自身抗體陰性者中有1 043例自愿接受胃鏡檢查，其中發(fā)現(xiàn)NOR(913例，87.54%)、BCH (79例，7.57%)、DYS (48例，4.60%)、SCC(1例)和OTH (2例，0.19%)，見表5。對226例進行內(nèi)鏡檢查的，通過黏膜病理活檢，共發(fā)現(xiàn)了85例食管癌前病變，早期食管癌為33例。發(fā)現(xiàn)隨著食管疾病的加重，血清自身抗體指標陽性檢出率也逐漸升高。而在對自身抗體陰性組進行內(nèi)鏡下黏膜病理活檢中，檢出食管癌1例，其他上消化道腫瘤2例。

表3 1 350例無癥狀人群性別、年齡分布 例(%)

表4 226例自身抗體陽性者的色素內(nèi)鏡下各級病變情況 例(%)

表5 血清自身抗體表達對應(yīng)內(nèi)鏡活檢病理結(jié)果 例(%)

2.3 大規(guī)模人群應(yīng)用自2010年至2019年，本研究團隊利用血清學(xué)自身抗體聯(lián)合檢測技術(shù)在河南林州地區(qū)進行了大規(guī)模人群推廣應(yīng)用。共篩查20 153例35～70歲無癥狀人群，確定了自身抗體陽性高危個體3 855例(19.13%，3 855/20 153)例。對這些高危人群進行色素內(nèi)鏡和食管黏膜病理學(xué)檢查，共發(fā)現(xiàn)食管上皮不典型增生(癌前病變)1 350例(35.02%，1 350/3 855)，上消化道腫瘤患者605例，包括544例食管癌和61例其他上消化道腫瘤；544例食管癌患者中，早期(T1N0M0)患者占95.04%(517/544)，見表6。同時對黏膜活檢不典型增生的1 350例無癥狀高危人群進行長達10 a的隨訪調(diào)查，共發(fā)現(xiàn)234例癌前病變發(fā)展為早期食管癌，癌變率達17.33%(234/1 350)。

表6 3 855例高危人群對應(yīng)色素內(nèi)鏡檢查各級病變結(jié)果 例(%)

3 討論

前期的研究發(fā)現(xiàn)，食管癌的發(fā)病是環(huán)境—遺傳—基因交互作用共同導(dǎo)致的結(jié)果[2]。腫瘤患者在表達腫瘤相關(guān)抗原時，血清中會產(chǎn)生多種抗腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體，可能作為腫瘤發(fā)生過程中識別異?；蚣毎麢C制失調(diào)的早期標志[15]。但目前尚未發(fā)現(xiàn)可以完全識別或區(qū)分腫瘤患者和正常人群任何單一血液指標。因此，聯(lián)合多個腫瘤標志物可能是腫瘤早期發(fā)現(xiàn)和診斷的潛在方法。

通過對第一組食管癌患者血清和正常人群血清中自身抗體的對比研究發(fā)現(xiàn)，cyclinB1、TGF-β1、Bcl-2、BRCA2這4種自身抗體在食管癌患者血清中的表達明顯高于正常人群。在對不同指標組合進行優(yōu)化時，發(fā)現(xiàn)當同時對4種自身抗體聯(lián)合檢測時，對食管癌診斷的靈敏度和特異性達到最好，可以更好地區(qū)分癌癥患者和正常人群。同時為了驗證指標組合的準確性，在第二組1 350例無癥狀人群進行了應(yīng)用驗證，對所有參與血清學(xué)檢測的人群進行了內(nèi)鏡檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自身抗體陽性人群中檢出食管癌前病變和食管癌的遠遠高于自身抗體陰性人群。對20 153例無癥狀人群中的陽性個體進行內(nèi)鏡活檢，檢出食管癌和癌前病變的概率與第二組人群接近，進一步證明了這4種自身抗體聯(lián)合檢測時的效能。

目前在臨床上，內(nèi)鏡檢查仍是早期食管癌前檢出的重要手段。本團隊總結(jié)了十余年食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群篩查的經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)在無癥狀高危人群篩查中，內(nèi)鏡檢查存在一定的局限性。接近80%的無癥狀人群在接受胃鏡檢查時屬于正常狀態(tài)，僅有20%的人群可以檢出病變。并且限于食管內(nèi)鏡的檢測效率低下、成本昂貴和缺乏經(jīng)驗豐富的內(nèi)鏡醫(yī)師，導(dǎo)致無法在大規(guī)模篩查中展開。因此加強對食管癌和癌前病變患者血清關(guān)鍵相關(guān)蛋白的甄別和鑒定，建立高危人群篩查的指標和方法十分重要[16]。本研究利用血清學(xué)檢測多種腫瘤相關(guān)自身抗體，在大規(guī)模人群應(yīng)用中較好地判定高危人群，縮小了內(nèi)鏡檢查范圍，在不降低檢出準確率的前提下，大大減少了盲目檢查的人數(shù)，提高了早期癌的檢出率，節(jié)約了檢查成本，值得在更大規(guī)模人群中推廣應(yīng)用。