何廷美，陳善瑜，施小剛，柴宜均，樊佳琦，羅靜怡，程躍鴻，彭廣能*

（1.四川臥龍國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局 四川阿壩 623006；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 成都 611130）

芽囊原蟲(chóng)（Blastocystis）是一種可寄生于人類(lèi)和多種動(dòng)物的厭氧性、單細(xì)胞腸道原蟲(chóng)，在全球廣泛分布，主要經(jīng)過(guò)糞口以及接觸傳播[1]。先前的報(bào)道表明，該寄生蟲(chóng)與腹瀉、腹痛和嘔吐等非特異性胃腸道癥狀相關(guān)，并疑似與腸易激綜合征（IBS）和蕁麻疹有關(guān)[2]。根據(jù)小亞基核糖體RNA（Small-subunit ribosomal RNA，SSU rRNA）基因序列差異，芽囊原蟲(chóng)目前可分為17 種亞型（ST1～ST17），其中ST1～ST9、ST12 亞型為人獸共患亞型，ST10～ST17 亞型僅感染動(dòng)物[3]。芽囊原蟲(chóng)已在人和多種動(dòng)物中被報(bào)道，其中鹿科動(dòng)物被報(bào)道的有梅花鹿、馬鹿、馴鹿[2,4,5]。2020 年4 月至5 月在對(duì)四川臥龍自然保護(hù)區(qū)野外野生動(dòng)物腸道寄生蟲(chóng)進(jìn)行調(diào)查的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)采集的水鹿（n=9）、毛冠鹿（n=4）糞便樣品檢出芽囊原蟲(chóng)并鑒定出所感染的亞型分別為ST14（n=2）、ST5（n=1)、ST13（n=1）。據(jù)查未見(jiàn)有關(guān)于水鹿、毛冠鹿感染芽囊原蟲(chóng)的報(bào)道。該調(diào)查擴(kuò)大了芽囊原蟲(chóng)的宿主范圍且提示水鹿是傳播人獸共患芽囊原蟲(chóng)的潛在宿主，具有一定的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

1 基本情況

2020 年4 月-5 月對(duì)臥龍自然保護(hù)區(qū)野外野生動(dòng)物腸道寄生蟲(chóng)調(diào)查時(shí)采集到的9 份水鹿（Rusa unicolor）糞便和4 份毛冠鹿（Elaphodus cephalophus）糞便。隨后針對(duì)該糞便樣品基于SSU rRNA 序列的PCR 擴(kuò)增方法檢測(cè)芽囊原蟲(chóng)。

2 方法

2.1 糞便基因組DNA 的提取

每份糞便取200～300mg 置于2mL 離心管中，加入蒸餾水，混勻，12,000r/min 離心1min，棄上清，重復(fù)上述步驟直至清洗干凈表面的重鉻酸鉀得到清亮透明的液體。隨后按照E.Z.N.A.?Stool DNA Kit糞便全基因組提取試劑盒（OMEGA Biotek Inc D4015-01，USA）說(shuō)明書(shū)的操作步驟提取DNA，操作完成后將DNA 放于 -20℃冰箱中待用。

2.2 PCR 擴(kuò)增及測(cè)序

用 PCR 技術(shù)基于芽囊原蟲(chóng) SSU rRNA 基因位點(diǎn)對(duì)所提取的DNA 樣品進(jìn)行擴(kuò)增，將試劑和樣品 DNA 混勻后的 PCR 管置于PCR 儀中反應(yīng)。根據(jù)文獻(xiàn)[6]中給出的引物和 NCBI 中的基因序列來(lái)設(shè)置引物和反應(yīng)條件與反應(yīng)體系。

1）引物：所需合成引物序列及產(chǎn)物DNA 片段大小見(jiàn)表1。

表1 芽囊原蟲(chóng)PCR引物

2）反應(yīng)體系：PCR 擴(kuò)增體系為25μL，見(jiàn)表2。

表2 反應(yīng)體系

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；93℃變性1min；59℃退火1min；72℃延伸1min；循環(huán)30 次；72℃再延伸3min；10℃永久保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后由上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行單向測(cè)序。

2.3 SSU rRNA 序列分析

測(cè)序后的序列在NCBI 的Blast 上進(jìn)行相似性比對(duì)，將所獲得的序列與GenBank 比對(duì)出來(lái)同源性最高序列進(jìn)行比較，確定序列是否是芽囊原蟲(chóng)的基因組，分析序列差異確定亞型。

3 結(jié)果

3.1 糞便中芽囊原蟲(chóng)SSU rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

9 份水鹿（Rusa unicolor）糞便和4 份毛冠鹿（Elaphodus cephalophus）糞便樣品中，擴(kuò)增出4 份約為600bp 的陽(yáng)性樣品，經(jīng)公司測(cè)序結(jié)果顯示，成功擴(kuò)增出的4 份樣品均是芽囊原蟲(chóng)陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性樣品分別來(lái)源于3 份水鹿、1 份毛冠鹿，表明這些水鹿、毛冠鹿都感染了芽囊原蟲(chóng)。

3.2 芽囊原蟲(chóng)SSU rRNA 的序列分析及亞型分布

測(cè)序成功的序列在Blast 上進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)果顯示有4 個(gè)芽囊原蟲(chóng)陽(yáng)性樣品，被分別歸為3 類(lèi)不同的序列，上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)為 MT889739、MT889740、MT764942、MT889741。其中毛冠鹿源芽囊原蟲(chóng)屬于ST13 亞型（MT889741）；另3 份水鹿芽囊原蟲(chóng)樣品中，1 份屬于ST5 亞型（MT889740），2 份為ST14（MT889739、MT764942）。

4 討論

芽囊原蟲(chóng)是人類(lèi)和各種動(dòng)物中最常見(jiàn)的寄生蟲(chóng)之一[7]。一些研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在發(fā)展中國(guó)家還是發(fā)達(dá)國(guó)家，芽囊原蟲(chóng)感染都與胃腸道和營(yíng)養(yǎng)紊亂有關(guān)[7]。除人類(lèi)外，該寄生蟲(chóng)還經(jīng)常在動(dòng)物宿主中發(fā)現(xiàn)，包括非人靈長(zhǎng)類(lèi)，以及其他哺乳動(dòng)物，如偶蹄目、犬齒目、嚙齒類(lèi)動(dòng)物、有袋類(lèi)動(dòng)物以及鳥(niǎo)類(lèi)、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)、環(huán)節(jié)動(dòng)物和昆蟲(chóng)[8,9]。但在偶蹄目鹿科動(dòng)物中目前已有梅花鹿、馬鹿和馴鹿感染芽囊原蟲(chóng)的報(bào)道[2,4,5]，沒(méi)有水鹿、毛冠鹿感染芽囊原蟲(chóng)的相關(guān)報(bào)道。本文是關(guān)于芽囊原蟲(chóng)感染水鹿、毛冠鹿的首次報(bào)道。

芽囊原蟲(chóng)目前可分為17 種亞型（ST1～ST17），其中ST1～ST9、ST12 亞型屬于人獸共患亞型，ST10～ST17 亞型僅感染動(dòng)物[3]。從偶蹄目中分離出的芽囊原蟲(chóng)有11 個(gè)亞型，包括7 個(gè)已知亞型（ST1、ST3、ST4、ST5、ST10、ST13、ST14）和4 個(gè)新亞型（Novel1、Novel2、Novel3、Novel4）。其中ST5 亞型最為普遍[9]。本文中所鑒定的亞型有ST14（n=2）、ST13（n=1）、ST5（n=1），其中ST14、ST13 為動(dòng)物特有的亞型僅感染動(dòng)物。ST5 為人畜共患亞型，該亞型在江西省的農(nóng)村地區(qū)小孩和豬身上被發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)很多家庭飼養(yǎng)小豬，豬和孩子有時(shí)會(huì)共用室外區(qū)域[10]。這些報(bào)告表明ST5 具有人畜共患的潛力，水鹿可能是芽囊原蟲(chóng)的潛在傳染源。

研究結(jié)果顯示，水鹿、毛冠鹿也是芽囊原蟲(chóng)的宿主之一，且發(fā)現(xiàn)了水鹿源的人畜共患亞型，表明水鹿是芽囊原蟲(chóng)人畜共患病的潛在傳染源。本文對(duì)水鹿、毛冠鹿感染芽囊原蟲(chóng)的首次報(bào)道使我們對(duì)芽囊原蟲(chóng)宿主有了更加全面的認(rèn)識(shí)。