胡棟寶，鄭付聰，楊 猛，張濟(jì)祥

(玉溪師范學(xué)院 化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院, 云南 玉溪 653100)

植物多酚是多羥基化合物總稱，具有抗氧化性、抗衰老、抗腫瘤等多種生物活性[1]，近年來多酚類物質(zhì)的活性研究已越來越多地引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注[2]。 黑牛肝菌(Boletusaereus)是一種可食用菌，口感香脆，味道鮮美，藥用價(jià)值頗高，含有多糖、多酚等多種活性成分，其多糖對小鼠酒精性肝損傷具有明顯保護(hù)作用[3-4]，其提取物對大鼠具有明顯的降血脂及抗氧化作用[5]。響應(yīng)面分析法是采用多元二次回歸方程作為函數(shù)來優(yōu)化提取工藝過程的一種高效實(shí)用的方法，可信度高，被廣泛應(yīng)用于各種化工過程的提取工藝優(yōu)化研究中。目前有關(guān)黑牛肝菌多糖的藥理活性報(bào)道較多[3-5]，但關(guān)于其響應(yīng)面法多酚提取及抗氧化活性的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。為了充分利用該食用菌資源，本研究利用超聲波輔助提取響應(yīng)面優(yōu)化法獲取黑牛肝菌多酚提取的最佳工藝條件，并利用DPPH自由基清除等試驗(yàn)研究黑牛肝菌多酚提取物的抗氧化活性，為該食用菌功效成分的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑牛肝菌(云南省玉溪市新平縣)；福林酚試劑(分析純,上海金穗生物科技有限公司)；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(分析純，武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司)； 1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(分析純，Sigma公司)；抗壞血酸(分析純，天津市雙船化學(xué)試劑廠)；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)(分析純，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸氫二鈉、過硫酸鉀(分析純，天津市鳳船化學(xué)試劑科技有限公司)；三氯乙酸(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；無水碳酸鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、無水乙醇(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)。

1.2 主要儀器

分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司)；超聲清洗儀(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司)；UV-2700紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)； SHZ -DS-III型循環(huán)水真空泵(河南鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；RE2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)液的配制

取0.005 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品蒸餾水溶解，置于50 mL容量瓶,定容至刻度線, 即得濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確量取上述標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于50 mL比色管中，依次加入30 mL蒸餾水、2.5 mL福林酚試劑、7.5 mL質(zhì)量百分?jǐn)?shù)10%的碳酸鈉溶液，于61℃水浴反應(yīng)10 min，全波長掃描，于770 nm測定吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)液為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=149.93x+0.0182,R2=0.9985。

1.3.3 樣品中多酚的測定

準(zhǔn)確吸取樣品溶液0.5 mL于50 mL比色管，分別加入30 mL蒸餾水、 2.5 mL福林酚試劑、7.5 mL質(zhì)量百分?jǐn)?shù)10%的碳酸鈉溶液,于61℃水浴反應(yīng)10 min，冷卻后在770 nm處測定其吸光度。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取量的影響

將黑牛肝菌子實(shí)體于60℃烘箱中烘3 h后,溫度調(diào)至80℃，烘干至恒重, 粉碎, 混勻,置于干燥器中待測。準(zhǔn)確稱取0.5000 g黑牛肝菌粉末，超聲提取20 min，在液料比為40∶1 (mL/g)，乙醇濃度設(shè)置為6個(gè)水平(30%、40%、50%、60%、70%、80%)，探究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取量的影響。

1.4.2 液料比對多酚提取量的影響

0.5000 g黑牛肝菌粉末,超聲提取20 min,乙醇濃度70%條件下，液料比設(shè)置6個(gè)水平(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL/g)，探究不同液料比對多酚提取量的影響。

1.4.3 超聲時(shí)間對多酚提取量的影響

0.5000 g黑牛肝菌粉末，超聲提取20 min，液料比為40∶1 (mL/g)，乙醇濃度70%，提取時(shí)間因素設(shè)置5個(gè)水平(10、15、20、25、30 min)，探究超聲時(shí)間對多酚提取量的影響。

1.4.4 提取次數(shù)對多酚提取量的影響

在超聲提取20 min，液料比為40∶1(mL/g)，乙醇濃度70%，提取次數(shù)因素設(shè)置5個(gè)水平(1、2、3、4、5次)，探究提取次數(shù)對多酚提取量的影響。

1.5 響應(yīng)面法試驗(yàn)

利用Design- Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)。按照單因素試驗(yàn)結(jié)果，響應(yīng)面試驗(yàn)選用乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、提取時(shí)間(C)和提取次數(shù)(D)四個(gè)因素作為試驗(yàn)因素，以多酚提取量為考察指標(biāo)，對黑牛肝菌中多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而找出其最佳工藝條件[7-11]，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.6 抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.6.1 清除DPPH自由基能力的測定

取1.00 mL DPPH溶液于比色管中，分別加入1.00 mL不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)的樣品溶液或Vc溶液，室溫避光反應(yīng)30 min，無水乙醇調(diào)零[10]，517 nm處測定其吸光值A(chǔ)2。

A1:反應(yīng)時(shí)間t=0時(shí)的空白吸光度；A2:樣品液或Vc溶液在室溫避光反應(yīng)30 min時(shí)的吸光度。

1.6.2 清除ABTS+自由基能力的測定

取4.00 mL ABTS+溶液于10 mL比色管中，分別加入1.00 mL不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)的樣品液或Vc溶液，反應(yīng)10 min，734 nm測吸光度A2[11]。

A1:空白對照的吸光度；A2:樣品液或Vc溶液的吸光度。

1.6.3 還原Fe3+能力的測定

取2.50 mL不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)的樣品液或Vc溶液于比色管中,依次吸取2.50 mL 濃度為 0.20 mol/L的磷酸緩沖溶液(pH 6.6)、2.50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀溶液，在50℃水浴20 min后快速冷卻，加入2.50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸溶液，靜置10 min，取上層清液2.50 mL，加入0.50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氯化鐵溶液室溫下放置10 min,700 nm下測定吸光度A[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇濃度對黑牛肝菌多酚提取量的影響

由圖1可知, 黑牛肝菌中多酚的提取量隨乙醇濃度的增大先增大后減小，濃度為60%時(shí)達(dá)到最大，之后乙醇濃度增大多酚提取量降低，原因可能是高濃度乙醇溶液會增大整個(gè)提取體系的粘度，不僅降低多酚的析出，還會增大一些醇溶型雜質(zhì)和多糖等一些大極性成分的溶出[13]。

圖1 乙醇濃度對黑牛肝菌多酚提取量的影響Fig. 1 Effects of ethanol concentration on the yield of polyphenols

2.1.2 液料比對黑牛肝菌多酚提取量的影響

如圖2所示，在液料比低于40∶1 mL/g時(shí)，其提取量隨著液料比的增大而漸漸升高，在液料比達(dá)到40∶1 mL/g時(shí)多酚提取量最大，之后則提取量逐漸降低，原因可能是在液料比40∶1 mL/g時(shí)多酚析出趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增加溶劑會提高多糖或其他雜質(zhì)的析出，從而使多酚的溶出受到抑制[14]。

圖2 液料比對黑牛肝菌多酚提取量的影響Fig.2 Effects of liquid-solid ratio on the yield ofpolyphenols

2.1.3 超聲提取時(shí)間對黑牛肝菌多酚提取量的影響

如圖3所示，黑牛肝菌中多酚的提取量隨超聲時(shí)間的增加先升后降， 在20 min時(shí)提取量最大，之后隨著超聲時(shí)間的增長提取量漸漸降低，原因可能是在20 min后由于提取時(shí)間過長有部分多酚發(fā)生了氧化反應(yīng)，從而降低了多酚的含量[15]。

圖3 超聲時(shí)間對黑牛肝菌多酚提取量的影響Fig.3 Effects of ultrasonic time on the yield of polyphenols

2.1.4 提取次數(shù)對黑牛肝菌多酚提取量的影響

如圖4所示，多酚提取量隨提取次數(shù)的增加而緩慢增大，提取次數(shù)為2次時(shí)多酚得率最高，繼續(xù)增加提取次數(shù)，長時(shí)間的超聲波作用會使原料細(xì)胞破裂程度加大，增加雜質(zhì)溶出，甚至破壞多酚物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，此結(jié)論與茹月蓉等[13]對青岡櫟果殼多酚的研究結(jié)果以及蘇適等[16]對無花果黃酮的研究結(jié)果一致。因此，選擇提取次數(shù)2次為較優(yōu)條件。

圖4 提取次數(shù)對黑牛肝菌多酚提取量的影響Fig.4 Effects of extraction times on the yield of polyphenols

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)Design-Expert軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，如表2所示。選取乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)和提取次數(shù)(D)為變量，選定響應(yīng)值(提取量)，進(jìn)行擬合分析，得到黑牛肝菌多酚提取量回歸方程。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

由表3可知，黑牛肝菌提取多酚的響應(yīng)曲面回歸模型的系數(shù)顯著性與方差分析結(jié)果，模型項(xiàng)F值為68.48,P<0.000 1極顯著性(P<0. 01),失擬項(xiàng)P=0.050 7不顯著(P>0.05),故利用此模型找到黑牛肝菌多酚提取量的最優(yōu)提取條件。 A、B和D三個(gè)因素對黑牛肝菌中多酚影響極顯著(P<0.01)。四個(gè)二次項(xiàng)曲面效應(yīng)也同樣明顯，AC、BC和CD交互項(xiàng)效應(yīng)影響極顯著，影響大小順序?yàn)?A乙醇濃度>D提取次數(shù)>B料液比>C超聲提取時(shí)間。

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)面分析

利用Design-Expert 軟件對黑牛肝菌中多酚含量開展二次多元回歸擬合，固定四個(gè)變量中的三個(gè)為不變值，把變量與另三個(gè)因素?cái)M合為三維曲面圖，擬合目標(biāo)函數(shù)為數(shù)學(xué)模型，進(jìn)而繪制因變量曲面圖，3D響應(yīng)曲面見圖5。通過響應(yīng)面分析，最終確定黑牛肝菌中多酚最佳提取條件，即乙醇濃度60%，液料比40∶1(mL/g)，超聲提取時(shí)間20 min，提取次數(shù)2次。

圖5 多酚含量與提取各因素間的交互作用Fig. 5 Response surface plots for the effects of cross-interactions among different factors on the extraction rate of polyphenol

2.3 結(jié)果與分析

2.3.1 清除DPPH自由基能力

如圖6所示，黑牛肝菌中多酚提取液和抗壞血酸溶液清除DPPH自由基的能力隨濃度增加效果也逐步增強(qiáng)，且在相同濃度條件下黑牛肝菌中多酚的清除率強(qiáng)于抗壞血酸溶液。當(dāng)濃度為0.1 mg/mL時(shí)，黑牛肝菌中多酚提取液的DPPH自由基清除率最高可達(dá)到95.45%。黑牛肝菌中提取的多酚具有強(qiáng)的體外抗氧化活性可能與其富含對苯二酚、對聯(lián)三苯酚類物質(zhì)有關(guān)[18]。

圖6 清除DPPH自由基能力Fig. 6 Result of DPPH scavenging activities

2.3.2 清除ABTS+自由基能力

如圖7所示，隨濃度增加，黑牛肝菌多酚提取液和抗壞血酸溶液對ABTS+自由基清除率逐漸增強(qiáng)。在濃度為0.04 mg/mL時(shí)，黑牛肝菌多酚提取液的清除率接近90%，對ABTS+自由基具有強(qiáng)的清除活性。

圖7 清除ABTS+自由基能力Fig. 7 Result of ABTS+ scavenging activities

2.3.3 還原Fe3+能力

如圖8所示，隨著黑牛肝菌提取液和抗壞血酸溶液濃度的增加，吸光度值呈遞增趨勢，對Fe3+還原能力增強(qiáng)，黑牛肝菌多酚提取液對Fe3+的還原能力在相同濃度下強(qiáng)于抗壞血酸溶液。

圖8 還原Fe3+能力Fig. 8 Result of reducing Fe3+ activities

3 結(jié) 論

利用響應(yīng)面法對黑牛肝菌中多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用DPPH自由基清除、ABTS+自由基清除及還原Fe3+三種實(shí)驗(yàn)方法測定了其抗氧化活性。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗(yàn)得到黑牛肝菌中多酚最優(yōu)提取工藝：乙醇濃度60%，液料比40∶1(mL/g)，提取時(shí)間20 min，提取次數(shù)2次。黑牛肝菌多酚抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明，黑牛肝菌多酚提取液具有強(qiáng)的清除DPPH自由基、ABTS+自由基及Fe3+還原能力，為黑牛肝菌資源的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。