郭 琴，駱 婕，廖鳳兒，陶 瑩

（廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院/臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科，廣東廣州 510080）

據(jù)統(tǒng)計，每7 對夫婦中就有1 對發(fā)生不孕，且這些不孕病例中有很大一部分病因直接或間接與女性肥胖有關(guān)［1］。育齡期肥胖的女性經(jīng)常會出現(xiàn)月經(jīng)周期紊亂、排卵障礙、流產(chǎn)風(fēng)險增加和妊娠時間延遲等生殖功能障礙類疾?。?-2］。另外，育齡期肥胖還是多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）發(fā)病的重要因素之一［3］。約30%～50%的育齡期肥胖女性是PCOS患者，而PCOS患者中肥胖女性占據(jù)50%～70%［4］。因此，不管是否PCOS，育齡期肥胖均可導(dǎo)致女性生殖功能障礙，但其中涉及的具體機制尚不完全清楚。

排卵障礙是女性生殖功能障礙的直接原因之一，卵泡發(fā)育異常是引起排卵障礙的病理基礎(chǔ)，而卵泡發(fā)育異常與卵巢顆粒細(xì)胞（granulosa cells，GCs）的凋亡調(diào)控失常有關(guān)［5］。肥胖女性的外周血和卵泡液中存在高水平循環(huán)的氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL），高水平的ox-LDL 能導(dǎo)致過量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成［6-7］。ROS 生成過多又是GCs損傷的主要危險因素之一［6-8］。體內(nèi)有多種酶參與了ROS 生成，其中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinu?cleotide phosphate，NADPH）氧化酶（NADPH oxi?dase，NOX）是細(xì)胞內(nèi)生成ROS 的主要酶體［9］。在肥胖育齡期女性中，體內(nèi)的代謝產(chǎn)物是否通過影響NOX 活性來影響卵泡發(fā)育和排卵尚不清楚。Shen等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，含F(xiàn) 框及WD 重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白7（F-box and WD repeat domain containing protein 7，F(xiàn)BW7）能通過抑制高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞中的NOX 活性來降低ROS 的生成。近來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BW7 可在腫瘤、動脈硬化和肥胖癥等疾病模型中參與調(diào)節(jié)氧化代謝、葡萄糖代謝和脂質(zhì)代謝等多種重要的生理學(xué)功能［11-13］。而在GCs 中，F(xiàn)BW7 是否通過調(diào)節(jié)NOX 活性參與肥胖導(dǎo)致的細(xì)胞損傷以及涉及的具體機制尚不清楚。因此，本研究旨在探討FBW7 在ox-LDL 引起的GCs 損傷中的作用及其潛在機制。

材料和方法

1 材料與試劑

胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基購于Gibco；ox-LDL和CCK-8 細(xì)胞活力檢測試劑盒購于廣州奕元生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；大鼠NOX 活性檢測試劑盒和人NOX 活性檢測試劑盒購于上海江萊生物科技有限公司；蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（cycloheximide，CHX）和蛋白酶體抑制劑MG132購于Sigma；編碼FBW7 的腺病毒載體（Ad-FBW7）、LacZ 載體、pcDNA3.1-NOX1 和pcDNA3.1 購于廣州銳博生物科技有限公司；抗FBW7和NOX1抗體購于Abcam；p47phox、p-p47phox、p67phox和p-p67phox抗體購于Cell Signaling Technology；GAPDH 抗體購于Santa Cruz。

2 受試者GCs的收集

收集同意參與本研究的育齡期（22～35歲）女性，并根據(jù)PCOS 診斷標(biāo)準(zhǔn)和體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI），將受試者分為正常體重（18.5 kg/m2＜BMI≤25 kg/m2）非PCOS 組、超重（25 kg/m2＜BMI＜30 kg/m2）非PCOS 組、肥胖（BMI≥30 kg/m2）非PCOS 組、正常體重（18.5 kg/m2＜BMI≤25 kg/m2）PCOS 組、超重（25 kg/m2＜BMI＜30 kg/m2）PCOS 組和肥胖（BMI≥30 kg/m2）PCOS組。本次研究納入的受試者排除：（1）既往3個月有酒精和藥物濫用或依賴；（2）合并嚴(yán)重的心血管、肝腎功能障礙、內(nèi)分泌、免疫或血液系統(tǒng)疾病；（3）卵巢癌、庫欣綜合征、甲狀腺功能異常、原發(fā)性卵巢早衰和藥物性高雄激素血癥患者。按照文獻(xiàn)［14］描述的方法收集受試者的GCs。收集的GCs 直接用于檢測FBW7表達(dá)、細(xì)胞活力和NOX活性。

3 方法

3.1 高脂飲食動物模型的建立與GCs分離 3周齡雌性SPF 級SD 大鼠購自中山大學(xué)動物實驗動物中心［SCXK（粵）2016-0029］，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實驗動物中心［SYXK（粵）2017-0125］SPF 級動物房內(nèi)，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行后續(xù)造模。大鼠分為標(biāo)準(zhǔn)飲食（standard diet，STD）組和高脂飲食（highfat diet，HFD）組。STD 飼料含15%脂肪、21%蛋白質(zhì)和64%碳水化合物；HFD 飼料含60% STD 飼料、35%豬油和5%膽固醇。兩組大鼠分別飼養(yǎng)4、8、12和16 周后，麻醉，摘取雙側(cè)卵巢，去除卵巢表面包膜和周圍脂肪組織后，放入DMEM 培養(yǎng)基中，在解剖顯微鏡下，刺破卵泡，收集GCs并過200目細(xì)胞篩，制成3×109/L 密度的細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中（含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基）。HFD 組大鼠GCs直接用于檢測FBW7 表達(dá)、細(xì)胞活力和NOX 活性，STD組大鼠GCs用于后續(xù)實驗。

3.2 ox-LDL 誘導(dǎo)大鼠GCs 損傷模型 取STD 組大鼠GCs，按照5×107/L 密度接種于96 孔板，然后分別給予終濃度為0、20、40、80 和160 mg/L ox-LDL 處理48 h。處理后的GCs 經(jīng)CCK-8 細(xì)胞活力試劑盒檢測細(xì)胞的相對活力，篩選ox-LDL最佳作用濃度。

3.3 腺病毒感染大GCs 取STD 組大鼠GCs，按照5×108/L 的密度接種于6 孔板，用Ad-FBW7 或Ad-Lacz 感染（MOI=40）細(xì)胞48 h。收集已感染的細(xì)胞，再分別用或不用ox-LDL（80 mg/L）刺激細(xì)胞48 h。

3.4 pcDNA3.1-NOX1 和pcDNA3.1 轉(zhuǎn)染 取已感染Ad-FBW7 的大鼠GCs，按照5×108/L 密度接種于6孔板，用HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑分別輔助轉(zhuǎn)染30 μmol/L的pcDNA3.1-NOX1或pcDNA3.1，48 h后收集細(xì)胞。收集已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，再分別用或不用ox-LDL（80 mg/L）刺激細(xì)胞48 h。

3.5 藥物處理 取已感染Ad-Lacz 或Ad-FBW7 的大鼠GCs，用或不用MG132（5 mg/L）處理細(xì)胞0.5 h后，再用ox-LDL（80 mg/L）和CHX（10 mg/L）分別刺激細(xì)胞0、12、24 和48 h，收集細(xì)胞用于Western blot檢測NOX1的表達(dá)。

3.6 CCK-8 法檢測GCs 的活力 取分離的人GCs、大鼠GCs和已處理的大鼠GCs，調(diào)整細(xì)胞密度為每孔1×104接種于96 孔板，分別培養(yǎng)48 h。待測孔加入10 μL CCK-8 溶液，再孵育2 h。用酶標(biāo)儀在波長490 nm處測量吸光度（A）值。

3.7 NOX 活性的檢測 按照NOX 活性檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，取分離的人GCs、大鼠GCs 和已處理的大鼠GCs，分別以5×107個/mL 的密度接種于96孔板，用NADPH 裂解液冰上超聲裂解20 s，然后以12 000×g離心5 min，收集上清。上清孵育光澤精（lucigenin）試劑（5 mmol/L），37℃避光孵育10 min，用光度計（Promega）測定背景的相對光單位（relative light unit，RLU）。然后加入NADPH（100 μmol/L）并反應(yīng)5 min，再次用光度計測定反應(yīng)的RLU。用BCA法定量上清中蛋白濃度。NOX 活性表示為單位時間（s）內(nèi)單位質(zhì)量（mg）蛋白的RLU。

3.8 Annexin V-FITC/PI 染色測細(xì)胞凋亡 取分離的人GCs、大鼠GCs 和已處理的大鼠GCs，跟據(jù)An?nexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒說明書步驟，加入500 μL 結(jié)合緩沖液并重懸細(xì)胞，然后分別加入5 μL Annexin V-FITC 和PI 染液并避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀讀取激發(fā)波長488 nm 和發(fā)射波長530 nm 處的熒光強度，并根據(jù)流式細(xì)胞儀自帶軟件分析其凋亡率。

3.9 Western blot 檢測蛋白的表達(dá) 取分離的人GCs、大鼠GCs 和已處理的大鼠GCs，用RIPA 細(xì)胞裂解液提取蛋白。蛋白用BCA 法定量為相同濃度后，取等量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 分離，并將電泳分離的蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。隨后用含5%脫脂奶粉的TBST 溶液將PVDF 膜在室溫中封閉1 h。室溫孵育1∶1 000 稀釋的I 抗（NOX1、p47phox、p67phox、pp47phox、p-p67phox和GAPDH）2 h 后，用TBST 洗PVDF膜3 次。室溫孵育對應(yīng)的II 抗1 h，用TBST 洗PVDF膜3 次。使用避光ECL 發(fā)光液顯影。用ImageJ 軟件分析條帶灰度值。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0 軟件包對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），再采用SNK-q檢驗進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肥胖抑制GCs的FBW7表達(dá)和細(xì)胞活力

Western blot 結(jié)果顯示，在非PCOS 組中，與正常體重非PCOS 組比較，超重或肥胖非PCOS 組GCs 的FBW7 表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）；在PCOS 組中，與正常體重PCOS 組比較，超重或肥胖PCOS 組GCs 的FBW7 表達(dá)也顯著降低（P＜0.05），提示肥胖能抑制GCs 中FBW7 表達(dá)，見圖1A。進(jìn)一步通過CCK-8 實驗分析各組GCs 的活力，結(jié)果顯示，不管是否PCOS患者，肥胖均能抑制GCs 的活力（P＜0.05），見圖1B。

2 HFD 導(dǎo)致大鼠GCs 的FBW7 表達(dá)和細(xì)胞活力降低

如圖2 所示，與STD 組比較，HFD 能抑制大鼠GCs 的FBW7 表達(dá)（圖2A）和細(xì)胞活力（圖2B），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 ox-LDL誘導(dǎo)大鼠GCs損傷并降低FBW7表達(dá)

如圖3所示，與對照組比較，ox-LDL能抑制大鼠GCs 的FBW7 表達(dá)（圖3A）和細(xì)胞活力（圖3B），并促進(jìn)其凋亡（圖3C），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

Figure 1.The FBW7 protein expression（A）and the viability（B）of the GCs from women of reproductive age in each group.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs normal-weight non-PCOS group；#P＜0.05 vs normal-weight PCOS group.圖1 各組育齡期女性GCs中FBW7表達(dá)和細(xì)胞活力的比較

Figure 2.The protein expression of FBW7（A）and the viability（B）of the rat GCs were decreased by high-fat diet（HFD）.W：weeks.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs standard diet（STD）group at the same time point.圖2 HFD導(dǎo)致大鼠GCs的FBW7表達(dá)和細(xì)胞活力降低

4 過表達(dá)FBW7 減輕ox-LDL 誘導(dǎo)的大鼠GCs損傷

如圖4 所示，通過感染Ad-FBW7 方式過表達(dá)大鼠GCs 中FBW7 表達(dá)（圖4A）后，與單純ox-LDL 刺激組比較，ox-LDL+Ad-FBW7 組GCs 的活力顯著增強（圖4B），細(xì)胞凋亡率顯著降低（圖4C），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

5 過表達(dá)FBW7 通過促進(jìn)NOX1 降解來減弱ox-LDL誘導(dǎo)的GCs中NOX活性

首先檢測受試者分離的GCs 的NOX 活性，結(jié)果顯示，不管是否PCOS 患者，肥胖均能顯著增強人GCs 中NOX 活性（P＜0.05），見圖5A。在大鼠模型中，與STD 組比較，HFD 組大鼠GCs 中NOX 活性顯著增強（P＜0.05），見圖5B。在ox-LDL 誘導(dǎo)的大鼠GCs 模型中，與對照組比較，ox-LDL 誘導(dǎo)的大鼠GCs中NOX活性同樣顯著增強（P＜0.05），見圖5C。

Figure 3.Stimulation with ox-LDL induced the injury of rat GCs and decreased FBW7 protein expression.The GCs isolated from nor?mal rats were treated with ox-LDL at concentration range of 20～160 mg/L for 48 h，and then FBW7 expression（A），cell vi?ability（B）and apoptosis（C）were detected by Western blot，CCK-8 assay and flow cytometry with Annexin V/PI staining，respectively.Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group.圖3 ox-LDL誘導(dǎo)大鼠GCs損傷并降低FBW7表達(dá)

進(jìn)一步檢測過表達(dá)FBW7 對ox-LDL 誘導(dǎo)的GCs中NOX 活性的影響，結(jié)果顯示，與單純ox-LDL 刺激組比較，ox-LDL+Ad-FBW7 組GCs 中NOX 活性顯著降低（P＜0.05），見圖6A。通過Western blot 檢測NOX 關(guān)鍵亞基蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與對照組比較，單純ox-LDL刺激組GCs的p-p47phox、p-p67phox和NOX1表達(dá)均顯著增加（P＜0.05）；而與單純ox-LDL 刺激組比較，ox-LDL+Ad-FBW7 組僅NOX1 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖6B～E。CHX 追蹤法結(jié)果顯示，與ox-LDL+LacZ 組比較，ox-LDL+Ad-FBW7 組NOX1 降解顯著加快（P＜0.05），見圖7A。MG132 刺激GCs 結(jié)果顯示，與ox-LDL+Ad-FBW7 組比較，ox-LDL+Ad-FBW7+MG132 組NOX1 表達(dá)明顯增加（P＜0.05），見圖7B。

6 過表達(dá)NOX1能逆轉(zhuǎn)過表達(dá)FBW7對ox-LDL 誘導(dǎo)的GCs損傷的抑制效應(yīng)

與ox-LDL+Ad-FBW7+pcDNA3.1 組比較，ox-LDL+Ad-FBW7+pcDNA3.1-NOX1 組大鼠GCs 中NOX1 表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05），見圖8A，說明FBW7 與NOX1 共過表達(dá)構(gòu)建成功。與ox-LDL+Ad-FBW7 組比較，ox-LDL+Ad-FBW7+pcDNA3.1-NOX1組大鼠GCs 中NOX 活性顯著增強（圖8B），細(xì)胞活力顯著降低（圖8C），細(xì)胞凋亡率顯著提高（圖8D），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

Figure 4.Over-expression of FBW7 attenuated ox-LDL-induced injury of rat GCs.Over-expression of FBW7 in rat GCs was con?ducted by infection with Ad-FBW7（MOI=40）prior to ox-LDL stimulation，and the FBW7 expression（A），cell viability（B）and apoptosis（C）were evaluated by Western blot，CCK-8 assay and flow cytometry with Annexin V/PI staining，re?spectively.Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ox-LDL stimulation alone group.圖4 過表達(dá)FBW7減輕ox-LDL誘導(dǎo)的大鼠GCs損傷

討 論

肥胖癥是一種與血脂異常、胰島素抵抗和氧化應(yīng)激等機體代謝因素密切相關(guān)的代謝綜合征。育齡期女性肥胖不僅能導(dǎo)致機體代謝紊亂，還會導(dǎo)致排卵障礙［1-2］。而肥胖引起育齡期女性排卵障礙的具體機制并不完全清楚。

Figure 5.NADPH oxidase（NOX）activity in the GCs isolated from obese women of reproductive age（A），the GCs isolated from high-fat diet（HFD）-fed rats（B），and the ox-LDL-stimulated GCs（C）.W：weeks.Mean±SD. n=10 in A；n=6 in B；n=4 in C.*P＜0.05 vs normal-weight non-PCOS group；#P＜0.05 vs normal-weight PCOS group；△P＜0.05 vs standard diet（STD）group；▲P＜0.05 vs control group.圖5 肥胖育齡女性分離的GCs、HFD喂養(yǎng)大鼠分離的GCs和ox-LDL刺激的GCs中NOX活性

Figure 6.Over-expression of FBW7 attenuated ox-LDL-stimulated NADPH oxidase（NOX）activity through specifically inhibiting NOX1 expression.Over-expression of FBW7 in rat GCs was conducted by infection with Ad-FBW7（MOI=40）prior to ox-LDL stimulation，and the NOX activity（A）and the expression of NOX-related proteins p-p47phox，p-p67phox and NOX1（B～E）in the rat GCs were detected.Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ox-LDL stimulation alone group.圖6 過表達(dá)FBW7通過抑制NOX1表達(dá)來減弱ox-LDL誘導(dǎo)的NOX活性

Figure 7.Over-expression of FBW7 accelerated NOX1 degradation in rat GCs under ox-LDL condition.A：the rat GCs were infected with LacZ or Ad-FBW7 prior to ox-LDL stimulation，cycloheximide（CHX）at 10 mg/L was added for the indicated period，and then the NOX1 expression was examined by Western blot；B：the rat GCs were pretreated with MG132 at 5 mg/L for 0.5 h followed by Ad-FBW7 infection in the absence or presence of ox-LDL，and then the NOX1 expression was examined by Western blot.Mean±SD. n=4.#P＜0.05 vs ox-LDL+LacZ group；*P＜0.05 vs LacZ group；&P＜0.05 vs ox-LDL+Ad-FBW7 group.圖7 在ox-LDL存在的情況下，過表達(dá)FBW7加速大鼠GCs的NOX1降解

卵泡閉鎖是排卵障礙的直接原因，而GCs 損傷是引起卵泡發(fā)育異常和閉鎖主要原因之一［5］。GCs不僅與卵巢中的卵泡膜細(xì)胞（theca cells）一起參與卵巢激素的合成和分泌，還能介導(dǎo)卵泡的生長、發(fā)育、閉鎖和排卵［15］。GCs增殖能促進(jìn)卵泡發(fā)育，而GCs凋亡則會導(dǎo)致卵泡閉鎖，尤其是在卵泡發(fā)育的后期［15］。已有研究表明，肥胖代謝產(chǎn)物能導(dǎo)致GCs 損傷［7，16］。因此，抑制GCs 損傷可以在一定程度上減輕肥胖導(dǎo)致的排卵障礙。肥胖育齡期女性的體內(nèi)存在氧化應(yīng)激和脂代謝異常，氧化應(yīng)激和脂代謝異常又能加劇不孕癥發(fā)生風(fēng)險。此外，氧化應(yīng)激和血脂異常也與GCs 損傷有關(guān)［16-17］。因此，本研究觀察不同肥胖程度對育齡期女性GCs 損傷的影響，結(jié)果顯示，不管是否發(fā)生PCOS，肥胖均能導(dǎo)致育齡期女性的GCs 活性降低并伴隨降低FBW7 表達(dá)。造成肥胖的起源因素眾多，但大部分肥胖癥病例是由于過度食用高脂肪食物造成的［18］。因此，本研究進(jìn)一步采用HFD 構(gòu)建大鼠模型，觀察HFD 對GCs 的影響，結(jié)果顯示HFD 能抑制GCs 活性和FBW7 表達(dá)。Liu 等［7］研究提示，肥胖導(dǎo)致卵泡閉鎖的可能原因是卵泡液中高水平ox-LDL 導(dǎo)致的GCs 氧化損傷。本研究進(jìn)一步用ox-LDL在體外模擬了肥胖背景下的GCs 損傷模型，結(jié)果同樣顯示，ox-LDL 能濃度依賴性抑制FBW7 表達(dá)?；谝陨辖Y(jié)果，我們推測FBW7 可能參與肥胖導(dǎo)致的GCs 損傷。為驗證我們的猜想，本研究在ox-LDL 誘導(dǎo)的GCs 模型中證明了過表達(dá)FBW7 能通過降低細(xì)胞凋亡水平來減輕ox-LDL誘導(dǎo)的GCs損傷。這一結(jié)果在一定程度上證明FBW7 參與調(diào)節(jié)肥胖導(dǎo)致的排卵障礙。

本研究進(jìn)一步探討FBW7 參與調(diào)節(jié)ox-LDL 導(dǎo)致GCs 損傷的機制。盡管肥胖癥的代謝產(chǎn)物能通過多種途徑導(dǎo)致GCs 損傷，但氧化應(yīng)激在GCs 的凋亡中起關(guān)鍵作用［6-7，16-17］。ox-LDL 能通過誘發(fā)GCs 中ROS過量生成進(jìn)而導(dǎo)致GCs 氧化損傷［7］。NOX 是細(xì)胞內(nèi)ROS 的主要來源［9］。在HFD 誘導(dǎo)的肥胖癥和動脈硬化癥模型中，F(xiàn)BW7 能通過降低NOX 活性來降低細(xì)胞內(nèi)ROS 的生成［11，13］。在本研究中，我們同樣發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FBW7 能降低GCs 中NOX 活性。為解釋FBW7 如何調(diào)節(jié)NOX 活性，我們進(jìn)一步檢測了NOX的關(guān)鍵亞基蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)FBW7 對ox-LDL 誘導(dǎo)的p-p47phox和p-p67phox表達(dá)無明顯影響，但抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的NOX1 表達(dá)。這一結(jié)果提示FBW7 可能通過抑制NOX1 表達(dá)來抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的NOX 活性。眾所周知，F(xiàn)BW7 能通過介導(dǎo)底物蛋白的降解來廣泛參與細(xì)胞的多種生物學(xué)功能［11-13］。為解釋過表達(dá)FBW7導(dǎo)致NOX1表達(dá)降低的原因，本研究用CHX 追蹤法研究了過表達(dá)FBW7 對NOX1 穩(wěn)定性的影響，結(jié)果顯示，在ox-LDL 刺激條件下，過表達(dá)FBW7能加速NOX1的降解。NOX家族的亞型蛋白可通過蛋白酶體降解途徑快速降解［19］。本研究結(jié)果顯示，在ox-LDL 刺激條件下，蛋白酶體抑制劑MG132 能恢復(fù)Ad-FBW7 導(dǎo)致的NOX1 表達(dá)下調(diào)。另外，外源性引入pcDNA3.1-NOX1 能逆轉(zhuǎn)Ad-FBW7 對ox-LDL 誘導(dǎo)的GCs 損傷的抑制效應(yīng)。以上結(jié)果說明，在ox-LDL 刺激條件下，過表達(dá)FBW7通過蛋白酶體降解途徑促進(jìn)NOX1 降解，從而降低NOX活性，減輕GCs損傷。

Figure 8.Over-expression of NOX1 reversed the inhibitory effect of over-expression of FBW7 on ox-LDL-induced injury of GCs.After co-transfected with Ad-FBW7 and pcDNA3.1-NOX1 prior to ox-LDL stimulation，the NOX1 expression（A），NOX activity（B），cell viability（C）and apoptosis（D）in rat GCs were examined.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ox-LDL stimulation alone group；&P＜0.05 vs ox-LDL+Ad-FBW7 group.圖8 過表達(dá)NOX1能逆轉(zhuǎn)過表達(dá)FBW7對ox-LDL誘導(dǎo)的GCs損傷的抑制效應(yīng)

綜上所述，本研究表明過表達(dá)FBW7 可通過加快NOX1 降解，進(jìn)而減弱NOX 活性來減輕ox-LDL 導(dǎo)致的GCs 損傷。另外，本研究結(jié)果還提示，上調(diào)FBW7 表達(dá)可能是肥胖癥誘發(fā)的排卵障礙類疾病的一個潛在治療策略。