魏思燦，林天來，黃 玲，蘇志偉，魏梅娟

（福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科，福建泉州 362000）

缺血性腦卒中是腦卒中死亡的首要原因，具有高致死率和高致殘率等特點［1-2］。使缺血的腦組織恢復血液供應，是急性腦梗死的主要治療目的，然而快速恢復缺血腦組織血液供應過程中，會對腦組織造成一定損傷，故臨床稱之為腦缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷［3-4］。I/R 的病理生理過程極為復雜，但近年來研究發(fā)現線粒體自噬在I/R 和腦卒中過程發(fā)揮重要作用［5-6］。PTEN 誘導激酶1（PTEN-in?duced putative kinase 1，PINK1）和帕金蛋白（parkin）協同作用可啟動線粒體自噬，特異性清除受損線粒體，保護組織免受損傷［7-8］。因此研究I/R過程中線粒體自噬相關蛋白PINK1/parkin 的表達及調控，對缺血性腦卒中的研究具有重要意義。槲皮素（querce?tin，QUE）是一種天然黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎和抗病毒等多種生理活性，且對心、肝、皮、肺、腎及神經系統(tǒng)等多種組織有保護作用，近年來研究發(fā)現槲皮素能減輕心、腎及腦等組織缺血再灌注損傷［9-10］，但對組織缺血損傷過程中線粒體自噬通路的調控作用尚未見報導。本研究建立大鼠I/R 腦損傷模型，在此基礎上探討槲皮素治療I/R 可能存在的新藥理機制，為臨床合理用藥提供參考。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級同遺傳背景SD 大鼠，體重200～220 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，動物生產許可證號為SCXK（粵）2018-0002，動物質量合格證號為SY2019071906。所有大鼠于本院動物房中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25℃，相對濕度50%，噪音低于80 分貝，保持動物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。本實驗經本院倫理委員會批準，符合3R原則。

1.2 主要試劑及儀器 槲皮素購自上海源葉生物科技有限公司，規(guī)格為20 mg，純度≥98%；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）購自Sig?ma；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司；丙二醛（malo?ndialdehyde，MDA）試劑盒購自上海滬震實業(yè)有限公司；白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰?；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒購自上海篤瑪生物科技有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）購自上海研卉生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自上海貝博生物科技公司；抗PINK1 和抗parkin、抗LC3-II 等抗體購自Abcam；BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶購自Pierce。RM2125RTS 型手動輪轉式切片機和EM ACE900 型電子顯微鏡購自Leica；SMZ745 型光學顯微鏡購自Nikon；1659001 型蛋白電泳儀和Trans-Blot SD 型半干轉膜儀購自Bio-Rad；GIS-500 型凝膠成像儀購自杭州米歐儀器有限公司等。

2 方法

2.1 大鼠I/R 模型的建立及分組給藥 取SD 雄性大鼠60 只，將其分為假手術（sham）組、模型組（I/R組）、QUE 組（10 mg/kg）、3-MA 組和QUE+3-MA 組，每組12 只。槲皮素藥物參照文獻［11］用生理鹽水稀釋成1 g/L的溶液，3-MA參照文獻［12］用磷酸緩沖溶液配制成100 moL/L 的溶液；槲皮素組按10 mg/kg 的劑量灌胃給予槲皮素；3-MA 組經腹腔注射給予3-MA 溶液2 μL；QUE+3-MA 組灌胃給予相應劑量的槲皮素，并經腹腔注射給予相應劑量的3-MA溶液；sham組和I/R 組均灌胃給予生理鹽水，并經腹腔注射給予磷酸鹽緩沖液。各組大鼠均給藥3 d，每次1 次。末次給藥30 min 后，除sham 組外，其于各組大鼠均參照文獻［10］構建大鼠I/R 腦損傷模型。具體操作方法為：3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，于枕骨下第一頸椎正中切水平切口，并暴露第一頸椎橫突，通過翼小孔，將一直徑為0.5 mm 的電凝針插入橫突孔，將兩側椎動脈電凝，永久性阻斷椎動脈血流，縫合切口。24 h 后再次麻醉大鼠，監(jiān)測腦電圖，腦電圖恢復正常，暴露并游離雙側頸總動脈，用無創(chuàng)動脈夾夾閉15 min（此時腦血供全部被阻斷造成全腦缺血，以腦電波變平為模型成功標志），然后開放動脈夾恢復血流灌注，縫合切口，待動物清醒后回籠飼養(yǎng)。Sham組暴露雙側椎動脈以及頸總動脈后予以縫合，待清醒后回籠飼養(yǎng)。各組大鼠在造模成功后，觀察神經功能行為，麻醉處死，取材并進行后續(xù)實驗。

2.2 神經功能缺損評分（neurological deficit score，NDS） 各組大鼠在造模成功后24 h，參照文獻［13］，進行NDS 評分。NDS 評分包含大體表現、腦干功能、運動評估、感覺功能、運動行為、行為學及驚厥情況七項功能，滿分80分，0分判定為腦死亡。

2.3 腦梗死體積的檢測 做完神經功能缺損評分后，隨機取6只大鼠，麻醉后立即取腦，迅速置于?20℃中冰凍。待組織凍硬后，在冰上將大腦由前向后做冠狀切片。放入質量分數為2%的TTC 染液中，37℃避光染色20 min，隔10 min 翻動一次。紅色為正常組織，白色為梗死灶。染色完成后，于質量分數為4%的多聚甲醛中固定，4℃過夜后拍照。用ImageJ 1.41軟件統(tǒng)計每個腦片梗死面積及正常組織面積，并計算梗死體積百分比：V（%）=（Al+A2+…+An）/（BI+B2+…+Bn）（A 為每個腦片梗死區(qū)域面積，B為每個腦片梗死側大腦半球面積，n為腦片序號）。

2.4 大鼠海馬組織的透射電鏡觀察 每組隨機取6只大鼠，用3%戊巴比妥鈉麻醉，心臟灌注（穿刺灌注20 min，生理鹽水灌注50～100 mL，4%多聚甲醛灌注150 mL）后迅速斷頭、取腦，剪取0.5 g 海馬組織，置于?80℃冰箱保存?zhèn)溆?，其余組織迅速置于4%中性多聚甲醛中固定24 h于冰上用雙面刀片切取海馬組織，切成5 μm 的切片，置于盛有預冷的體積分數4%的戊二醛中，用電鏡觀察線粒體形態(tài)。

2.5 大鼠海馬組織IL-6、TNF-α、SOD 活性和MDA含量檢測 取2.4 中?80℃保存的海馬組織，于4℃條件下解凍后，通過勻漿器以1∶9 的比例均化樣品和生理鹽水制備腦勻漿（10%），3 000 r/min 冷凍離心4 min，獲得上清液，按ELISA 試劑盒說明書檢測IL-6 和TNF-α 含量。按SOD 和MDA 試劑盒說明書分別采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸縮合法檢測海馬組織SOD 活性和MDA 含量。剩余腦組織勻漿液迅速置于?20℃冰箱中保存。

2.6 Western blot 檢測海馬組織PINK1、parkin 及LC3-II 蛋白的相對表達水平 取2.5 中剩余組織勻漿液，于4℃冰箱中解凍后，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，蛋白定量BCA 試劑盒檢測蛋白總濃度后，取50 μg 蛋白上樣，進行電泳和轉膜反應，TBST 溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST 溶液清洗3 次后，加入Ⅰ抗［PINK1、parkin 和LC3-II 抗體1∶1 000 稀釋，β-actin（內參照）抗體1∶2 000 稀釋］，4℃搖床中孵育過夜，加TBST 振洗后加入HRP 標記羊抗鼠II 抗（稀釋倍數1∶2 000），37℃搖床中孵育1 h，TBST清洗3次后，采用增強化學發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以ImageJ 軟件分析各組蛋白相對表達量。

3 統(tǒng)計學處理

以SPSS 22.0軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較進行單因素方差分析，進一步兩組間比較行SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組大鼠NDS評分結果

與sham組相比，I/R組、QUE+3-MA組、QUE組及3-MA組大鼠NDS評分降低（P＜0.05），腦梗死體積增大（P＜0.05）；與I/R 組和QUE+3-MA 組相比，QUE 組NDS 評分升高（P＜0.05），腦梗死體積減小（P＜0.05），3-MA組NDS評分降低（P＜0.05），腦梗死體積增大（P＜0.05）；I/R 組與QUE+3-MA 組相比，上述指標的差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05），見表1。

2 各組大鼠腦梗死體積檢測結果

TTC 染色顯示，sham 組大鼠的大腦組織呈均勻淡紅色，無腦梗死病灶；與sham組相比，I/R組、QUE+3-MA 組、QUE 組及3-MA 組腦梗死部位被染成白色，且梗死體積增大（P＜0.05）；與I/R組及QUE+3-MA組相比，QUE 組腦梗死體積縮?。≒＜0.05），而3-MA 組腦梗死體積增大（P＜0.05）；I/R 組與QUE+3-MA 組相比，上述指標的差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05），見圖1、表1。

3 各組大鼠海馬組織線粒體結構檢測結果

Sham 組大鼠海馬組織線粒體形態(tài)正常；I/R 組及QUE+3-MA 組海馬組織線粒體腫脹、內部嵴破壞或消失嚴重，并有自噬溶酶體形成；與I/R組及QUE+3-MA組相比，QUE組海馬組織線粒體腫脹及內部嵴破壞明顯減輕，形態(tài)較為正常，自噬溶酶體形成較多；而3-MA 組海馬線粒體結構有空泡樣變性，且破壞明顯，見圖2。

Figure 1.TTC-stained cerebral infarction map of rats in each group.圖1 各組大鼠TTC染色腦梗死圖

表1 各組大鼠NDS評分和腦梗死體積的比較Table 1.Comparison of NDS and cerebral infarction volume of rats in each group（Mean±SD）

Figure 2.Ultrastructure of mitochondria in hippocampus tissues of various groups.The black arrows indicate mitochondria，and the red arrows indicate autophagolysosome.The scale bar=500 nm.圖2 各組大鼠海馬組織線粒體超微結構圖

4 各組大鼠海馬組織氧化應激相關蛋白及炎癥因子表達的結果

與sham組相比，I/R組、QUE+3-MA組、QUE組及3-MA 組大鼠海馬組織的IL-6、TNF-α 和MDA 含量升高（P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05）；與I/R 組和QUE+3-MA 組相比，QUE 組的IL-6、TNF-α 和MDA 含量降低（P＜0.05），SOD 活性升高（P＜0.05）；而3-MA組大鼠海馬組織的IL-6、TNF-α和MDA含量升高（P＜0.05），SOD活性降低（P＜0.05）；I/R 組與QUE+3-MA組相比，上述指標的差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05），見表2。

5 各組大鼠海馬組織PINK1、parkin 和LC3-II 蛋白的表達結果

與sham 組相比，I/R 組、QUE+3-MA 組、QUE 組及3-MA 組大鼠海馬組織的PINK1、parkin 和LC3-II蛋白表達升高（P＜0.05）；與I/R組和QUE+3-MA組相比，QUE 組海馬組織的PINK1、parkin 和LC3-II 蛋白表達升高（P＜0.05），而3-MA 組的PINK1、parkin、LC3-II 蛋白表達降低（P＜0.05）；I/R 組與QUE+3-MA組相比，上述指標的差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05）。見圖3、表3。

表2 各組大鼠海馬組織IL-6、TNF-α和MDA含量及SOD活性比較Table 2.Comparison of IL-6，TNF-α，MDA and SOD levels in hippocampus tissues of various groups（Mean±SD. n=6）

Figure 3.Western blot for protein expression of PINK1，parkin and LC3-II in hippocampus tissue of rats.圖3 各組大鼠海馬組織PINK1、parkin和LC3-II的蛋白表達

表3 各組大鼠海馬組織PINK1、parkin和LC3-II蛋白表達比較Table 3.The protein expression of PINK1，parkin and LC3-II in the hippocampus of rats（Mean±SD. n=6）

討 論

I/R 過程中氧化應激及炎癥反應，會引起腦組織損傷，造成患者癱瘓、視聽覺消失及癡呆等行為，而運動、感覺及認知等神經功能異常行為，可間接反映大鼠腦損傷程度［14］。本研究發(fā)現，與sham組相比，I/R模型組大鼠NSD 評分明顯降低，腦梗死體積增大，海馬組織中氧化應激指標SOD 活性降低，MDA 含量升高，炎癥指標IL-6 和TNF-α 含量均升高，提示I/R 組大鼠腦組織可能發(fā)生炎癥及氧化應激反應，大鼠出現神經功能受損及腦組織損傷，表明造模成功。

槲皮素具有抗炎和抗氧化作用，近年發(fā)現其可抵抗I/R 腦損傷，且受到研究者的關注。黃超等［15］發(fā)現槲皮素可通過降低氧化應激反應、拮抗炎癥反應、抑制神經細胞細胞凋亡等途徑治療創(chuàng)傷性腦損傷。楊青麗等［16］發(fā)現槲皮素對缺氧缺血性腦損傷神經元細胞有保護作用。本研究發(fā)現，與I/R 模型組相比，槲皮素組大鼠NSD 評分升高，全腦梗死體積、IL-6、TNF-α及MDA含量降低，SOD活性升高，表明槲皮素可抑制I/R 模型大鼠氧化應激反應及炎癥損傷，減輕腦組織損傷，與上述文獻研究一致。

線粒體功能紊亂，也是腦I/R 中腦組織及細胞損傷的關鍵因素之一［5］。但線粒體自噬在I/R 過程中的作用也一直存在爭議，李翔等［17］發(fā)現誘導自噬可抑制腦I/R 中神經細胞損傷和組織損傷，左瑋等［18］發(fā)現通過激活線粒體自噬，可改善I/R。而Shi 等［19］及Zhou 等［20］發(fā)現抑制線粒體自噬，可達到抑制自噬性細胞死亡的目的。本研究發(fā)現，與Sham 組相比，I/R模型組大鼠腦組織出現線粒體腫脹、內部嵴破壞或消失、結構空泡樣等嚴重病理變化，提示I/R 模型大鼠線粒體結構及功能損傷，自噬清除受損細胞功能受到抑制。有文獻研究發(fā)現，槲皮素可激活線粒體自噬，緩解組織損傷。馬玉珍等［21］發(fā)現槲皮素可促進骨骼肌線粒體自噬蛋白的表達，抑制炎癥反應，發(fā)揮保護效應；黃超等［15］發(fā)現槲皮素可改善腦創(chuàng)傷性損傷組織中線粒體能量代謝，保護腦組織。然而，槲皮素對腦I/R 過程中線粒體功能的影響還未見報導。本研究結果顯示，與I/R 模型組相比，槲皮素組大鼠海馬組織線粒體病理變化明顯減輕，表明槲皮素可減輕I/R 模型大鼠腦組織中線粒體損傷，保護線粒體功能。而槲皮素保護和改善I/R 腦組織線粒體功能的具體機制還不明確。

PINK1 是線粒體外膜蛋白，可作為線粒體受損的分子感受器，parkin 介導底物泛素化后，與LC3-II及ATP 酶增強子連接，產生線粒體自噬體［22］。葉亮等［12］發(fā)現抑制PINK1/parkin 通路蛋白表達，可使線粒體自噬水平降低，線粒體損傷及腦損傷加重。Wu等［23］發(fā)現激活PINK1/parkin 通路，可抑制腦神經細胞凋亡，發(fā)揮腦保護作用。本研究發(fā)現，與sham 組相比，I/R 模型組大鼠海馬組織PINK1、parkin 及LC3-II 蛋白表達均增高，表明I/R 模型大鼠機體腦組織中線粒體自噬水平升高。而槲皮素組大鼠海馬組織PINK1、parkin 及LC3-II 蛋白表達均明顯高于I/R 模型組，推測槲皮素可進一步促進線粒體自噬，來抵抗I/R 大鼠腦組織氧化應激及炎性損傷，表明槲皮素可能是通過促進PINK1、parkin 蛋白表達，激活線粒體自噬來抵抗腦組織損傷的。為了驗證這一推測，本研究設置PINK1/parkin 通路抑制劑3-MA 進行研究，發(fā)現與I/R 模型組及槲皮素組相比，3-MA 組大鼠PINK1、parkin 和LC3-II 蛋白均顯著降低，且NSD 評分降低，腦梗死體積增大，海馬組織中SOD 活性降低，MDA、IL-6 和TNF-α 含量均升高，海馬組織線粒體病理變化進一步加重，表明采用PINK1/parkin 抑制劑抑制線粒體自噬激活，可加重腦組織氧化應激及炎癥損傷，從而加重腦組織損傷。而3-MA 與槲皮素聯合應用后，大鼠上述指標與I/R 模型組相比無明顯差異，表明3-MA 可逆轉槲皮素激活I/R 模型大鼠腦組織線粒體自噬及改善腦損傷的作用，進一步證明槲皮素可能通過激活PINK1/parkin 通路，激活線粒體自噬，進而減輕腦I/R損傷。

綜上所述，槲皮素可通過調控PINK1/parkin 通路蛋白表達，激活線粒體自噬，減輕腦I/R 損傷，為闡明和開發(fā)槲皮素治療I/R 損傷提供一定參考。但腦I/R 過程中線粒體自噬體系相當復雜，而槲皮素調控線粒體自噬緩解腦I/R 損傷的其他分子生物學機制有待后續(xù)繼續(xù)深入研究。