季樹宇，歐陽春艷，曹 會，鐘永浩，楊禮騰，劉曉宇

德國小蠊，屬蜚蠊目姬蠊科，為蜚蠊目中分布最為廣泛、與人類生活最為密切的一類醫(yī)學(xué)昆蟲，廣泛分布于全球熱帶、亞熱帶、溫帶中低海拔濕潤地區(qū)[1]，在我國大部分省市均有廣泛分布。其排泄物、分泌物、尸體及皮蛻通過吸入途徑可引起I型超敏反應(yīng)，進(jìn)而誘發(fā)過敏性哮喘、過敏性鼻炎和過敏性皮炎等疾病[2-3]，據(jù)季文霞等人的調(diào)查顯示四川綿陽地區(qū)吸入性過敏原陽性結(jié)果前五位的分別是蟑螂、粉塵螨、屋塵螨、藜、大豚草[4]，由此可見，蟑螂為重要吸入性過敏原疾病之一，其陽性率高達(dá)42.2%。李春林等人在海南對500例過敏性疾病患者，采用皮膚點刺試驗及鼻黏膜激發(fā)試驗，其中皮膚點刺試驗陽性率為66.20%，而鼻黏膜激發(fā)試驗陽性率為100%[5]。國內(nèi)對德國小蠊過敏原Bla g 5尚未見報道，故本研究通過基因重組技術(shù)將德國小蠊主要過敏原Bla g 5基因?qū)氪竽c桿菌，通過純化最終得到純度較高的重組蛋白，為臨床診斷過敏性疾病試劑研發(fā)、精準(zhǔn)脫敏治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器

1.1.1表達(dá)載體與菌種E.coli感受態(tài)細(xì)胞Rosetta(DE3)及載體pET-32a(+)均由深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院過敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所保存。

1.1.2血清 過敏患者由深圳市龍崗耳鼻喉醫(yī)院提供，血清采集均獲得供血者知情同意。對20 例過敏性哮喘和過敏性鼻炎患者行靜脈穿刺，采血 5 mL，分裝后低溫-80℃保存。

1.1.3主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶BamHI、XhoI，Taq DNA聚合酶，T4 DNA連接酶均購自日本TaKaRa 公司；Ni-NTA柱填料購自廣州佰路生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記小鼠抗人IgE Fc端二抗購自深圳市華爾康生物科技有限公司。

1.1.4主要儀器材料 體視顯微鏡購自深圳市富途銳科技有限公司；超凈工作臺購自新加坡藝思高科技有限公司；低溫高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；水流抽氣泵購自日本東京理化；PCR儀，蛋白純化儀均購自美國BIO-RAD公司；超聲波破碎儀購自美國Sonics公司；低溫?fù)u床購自上海智城分析儀器制造有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自廣州迅益生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1德國小蠊總RNA提取 取本實驗室飼養(yǎng)的德國小蠊20 只(成蟲), 液氮中均勻研磨蟲體后，用Qiagen 公司試劑盒進(jìn)行總 RNA 的提取。

1.2.2設(shè)計引物 從UniProt導(dǎo)出Bla g 5序列(登錄ID為O18598)利用Primer Premier設(shè)計上、下游引物，使引物退火溫度在50 ℃～70 ℃之間，且上下引物間退火溫度不超過5 ℃，引物設(shè)計完成后交托上海生工生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行合成。

1.2.3對目的基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增 以德國小蠊總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行目標(biāo)基因擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增體系為：ddH2O 11.78 μL、25 mmol/L MgCl21.4 μL、25 μmol/L dNTP 0.16 μL、5 U/L Taq polymerase 0.16 μL、2 μmol/L primer 2.5 μL、40 ng/μL cDNA 2 μL、10X PCR buffer 2 μL；擴(kuò)增條件：為94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性1 min、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)35次，最后一次72 ℃延長至10 min，瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，并將少量PCR產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4基因表達(dá)載體構(gòu)建 將序列正確的PCR產(chǎn)物與pET-28a(+)載體進(jìn)行HindIII和XhoI雙酶切，通過T4連接酶催化DNA 5′-P末端與3′-OH末端之間的磷酸二酯鍵結(jié)合，成功構(gòu)建基因表達(dá)載體，以CaCl2法將載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞Rosetta(DE3)，以含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌，用無菌牙簽挑取單克隆菌落接種至5 mL LB培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心集菌后提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定該載體是否正確連接目的基因。

1.2.5利用重組大腸桿菌表達(dá)目的蛋白 將成功轉(zhuǎn)入目的基因的大腸桿菌為工程菌進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，以IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在37 ℃誘導(dǎo)4 h以及在16 ℃環(huán)境下誘導(dǎo)12 h，誘導(dǎo)完成后在低溫4 ℃條件下以10 000 r/min速度離心并收集菌體，加入磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline)重懸，超聲破碎儀進(jìn)行破碎，超聲破碎所得菌液進(jìn)行低溫超速離心10 000 r/min 30 min，傾倒法分離上清與沉淀，分別取誘導(dǎo)前全菌重懸液、低溫誘導(dǎo)上清、低溫誘導(dǎo)沉淀重懸液、高溫誘導(dǎo)上清、高溫誘導(dǎo)沉淀重懸液60 μL，分別各自加入20 μL 4x loading buffer，99 ℃恒溫水浴鍋加熱9 min，經(jīng)短暫離心后取5 μL樣品進(jìn)行聚乙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電泳完畢后立即用考馬斯亮藍(lán)R-250(Coomassie brilliant blue R-250)，凝膠成像儀中觀察。

1.2.6金屬螯合離子層析法純化目的蛋白 將上述剩余菌體進(jìn)行純化，硫酸鎳(Nickel sulfate)沖柱，ddH2O沖柱，平衡緩沖液buffer A沖柱(500 mmol/L Sodium chloride，50 mmol/L Tris，pH8.0)，柱體積buffer A洗脫未結(jié)合雜蛋白，buffer B(50 mmol/L Tris，15非特異性蛋白，buffer C沖柱洗特異性蛋白，取少量純化進(jìn)行SDS-page電泳分析。

1.2.7重組蛋白Western blot分析 取純化蛋白樣SDS-PAGE電泳將蛋白轉(zhuǎn)移到經(jīng)甲醇活化的PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜完成后以TBST洗PVDF膜多次，加入5%脫脂奶粉封閉1 h，以20例過敏患者混合血清為一抗在4 ℃恒溫條件下孵育過夜。加入Mouse Anti-Human IgE Fc-HRP為二抗，TBST洗膜去除未結(jié)合的二抗。ECL超敏發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像儀觀察顯色反應(yīng)。

1.2.8Bla g 5的生物信息學(xué)分析 從GenBank中下載Bla g 5氨基酸序列(GenBank ID為U92412)，通過SWISS-MODEL預(yù)測Bla g 5蛋白三維結(jié)構(gòu)；通過DNA Star-LaserGene系統(tǒng)預(yù)測Bla g 5理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、親水性、表面可及性、抗原指數(shù)。并利用Pblast搜索Bla g 5的同源序列，并從檢索結(jié)果中人工挑選出與Bla g 5同源的非冗余序列，對挑選出來的序列使用Clustal W 2.1進(jìn)行多序列比對，為保證系統(tǒng)發(fā)生樹的可靠性，本研究中同時采用NJ法、ML法兩種方法建樹，在構(gòu)建NJ樹之前計算pairwise Jukes-Cantor(JC)平均距離，(該值大于1時數(shù)據(jù)集不適合使用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹)，替代模型選擇p-distance model，空位處理選擇pairwise deletion。在構(gòu)建ML樹之前先預(yù)測最適合數(shù)據(jù)集的進(jìn)化模型。NJ法與ML法均采用Bootstrap method進(jìn)行檢驗，檢驗次數(shù)為500次，且建樹過程均在MEGA-X中進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1Blag5基因表達(dá)載體的構(gòu)建 將Blag5基因連接至pET-28a(+)載體，以限制酶BamHI、XhoI雙酶切鑒定其為陽性，其核酸在瓊脂糖電泳與Bla g 5 cDNA長度基本一致，pET-28a(+)-Bla g 5表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖1)。

M：DNA Marker；1：pET-28a Blag 5 質(zhì)粒雙酶切后片段

2.2重組Bla g 5表達(dá)及純化 工程菌Rosetta(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及純化后，其表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE可見25 kDa處有明顯條帶，與預(yù)期分子量接近，由此得到部分可溶性重組蛋白(圖2)。重組蛋白大量表達(dá)后經(jīng)Ni柱純化，純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示在分子量25 kDa處可見明顯條帶(圖3)。

M:Protein marker；1：誘導(dǎo)前; 2：37 ℃誘導(dǎo)全菌液; 3：37 ℃誘導(dǎo)上清；4：37 ℃誘導(dǎo)沉淀；5：16 ℃誘導(dǎo)全菌液；6：16 ℃誘導(dǎo)上清; 7.16 ℃誘導(dǎo)沉淀

圖3 重組Bla g 5蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

2.3重組Bla g 5的免疫原性鑒定 以20例過敏患者血清混合為一抗，以Mouse Anti-Human IgE Fc-HRP為二抗，血清特異性反應(yīng)為陽性，而健康對照者血清反應(yīng)為陰性(圖4)。

M：Protein marker; 1：Bla g 5重組蛋白

2.4 Bla g 5 生物信息學(xué)分析

2.4.1SWISS-MODLE同源建模 GMQE值為0.99(GMQE為全局模型質(zhì)量評估，其置信度范圍為 0～1,越接近1，模型可信度越高)、QMEAN值為-0.24,提示預(yù)測可信度較高(其置信度范圍應(yīng)該-4～0，越接近0，模型可信度越高)，同源建模提示Bla g 5為具有同源二聚體結(jié)構(gòu)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(圖5)。

圖5 Bla g 5的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4.2Bla g 5的理化性質(zhì)預(yù)測 采用EditSeq對德國小蠊Bla g 5理化性質(zhì)進(jìn)行分析顯示其理論分子量為22 947.21道爾頓，其理論等電點為6.620，組成Bla g 5的200個氨基酸中有28個強(qiáng)堿性氨基酸，29個強(qiáng)酸性氨基酸；71個疏水性氨基酸，42個親水性氨基酸。

2.4.3Bla g 5二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要包括α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角(Turn)、無規(guī)則卷曲(Coil)等。應(yīng)用DNA Star Protean軟件提供的模塊，采用Garnier-Robson法預(yù)測Bla g 5二級結(jié)構(gòu)，其共含200個氨基酸，二級結(jié)構(gòu)以α螺旋為主，并伴有相當(dāng)量的β折疊、Turn、Coil，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜(圖6)。

圖6 Bla g5的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4.4Bla g 5親水性預(yù)測 過敏原親水性與過敏原表位相關(guān)性較高，蛋白質(zhì)親水性越高，親水性區(qū)域暴露在表面更易形成抗原表位的可能性越大。應(yīng)用DNA Star Protean軟件提供的模塊，采用Kyte-Doolittle 法預(yù)測Bla g 5親水性，其親水區(qū)域約占總序列的57%(圖7)。

圖7 Bla g 5的親水性預(yù)測

2.4.5Bla g 5可塑性預(yù)測 一般來說，蛋白構(gòu)象可塑性越強(qiáng)，越易形成抗原表位，應(yīng)用DNA Star Protean軟件提供的模塊，采用Karplus-Schul 法預(yù)測Bla g 5可塑性，其可塑性區(qū)域占48%，提示Bla g 5可塑性較好，易形成抗原表位(圖8)。

圖8 Bla g5的可塑性預(yù)測

2.4.6Bla g 5抗原性預(yù)測 抗原性預(yù)測基于已研究透徹的蛋白質(zhì)，抗原指數(shù)越高則說明該氨基酸在抗原區(qū)出現(xiàn)的頻率越高，應(yīng)用DNA Slar Prolean軟件提供的模塊，采用Jameson-Wolf 法預(yù)測Bla g 5抗原性(圖9)。

圖9 Bla g5的抗原性預(yù)測

2.4.7Bla g 5表面可及性預(yù)測 表面可及性代表蛋白質(zhì)氨基酸殘基被其他分子接觸到的可能性，表面可及性越高越易形成抗原表位。應(yīng)用DNA Slar Prolean軟件提供的模塊，采用Plot-Emini法預(yù)測Bla g5表面可及性，其表面可及性平均值為1.3(圖 10)，提示Bla g 5蛋白易形成抗原表位。

圖10 Bla g5的表面可及性預(yù)測

2.4.8Bla g 5同源性分析 為了確定Bla g 5與同源序列之間的關(guān)系，我們利用pblast進(jìn)行同源性搜索，并從檢索結(jié)果中挑選出14條與Bla g 5同源的非冗余序列(表1)。在構(gòu)建NJ樹之前計算得pairwise Jukes-Cantor(JC)平均距離為0.38，表明數(shù)據(jù)集適合使用NJ法，最終得到NJ樹如圖11。在構(gòu)建ML樹之前，根據(jù)BIC標(biāo)準(zhǔn)選擇最佳進(jìn)化模型為LG+G(Lgmodel+Gamma distributed)最終得到ML樹如圖12。系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果顯示，我們所選取的14個物種中與德國小蠊(Blattellagermanica)親緣關(guān)系最近的是柑橘木虱(Diaphorinacitri)，具有典型的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)特征。

表1 Bla g 5同源序列

圖11 Bla g 5系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(NJ法)

注：本實驗只旨在找出與Bla g 5進(jìn)化距離最近的序列，進(jìn)而推測Bla g 5的生物學(xué)性質(zhì)，因而不需要引進(jìn)外類群以確定誰是誰的祖先。

3 討 論

德國小蠊(Blattellagermanica)是世界性家居衛(wèi)生害蟲之一，其繁殖能力強(qiáng)，德國小蠊從卵孵化到性成熟需15～30 d，且德國小蠊單個卵莢中所含卵數(shù)量大于其他蜚蠊目，雌蟲可攜帶卵莢直至若蟲孵化，避免了外界不利環(huán)境對德國小蠊幼蟲的影響。由于其高繁殖潛力，其對殺蟲劑的抗藥性也越來越強(qiáng)[6-7]，種種因素導(dǎo)致德國小蠊成為人類棲息地最常見害蟲之一。

研究表明德國小蠊皮屑脫落物及排泄物和分泌物可誘導(dǎo)Ig E介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)[8]，吸入可累及皮膚、呼吸道、胃腸道，引起蕁麻疹、鼻炎哮喘等過敏反應(yīng)性疾病，L.Karla Arruda等人指出Bla g 5 本質(zhì)為德國小蠊谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)[9]，昆蟲GST被認(rèn)為在蟑螂攝入的食物和其他物質(zhì)的解毒過程中起著重要的生理作用。昆蟲體內(nèi)GST產(chǎn)量的上調(diào)與對殺蟲劑(特別是有機(jī)磷)的抗藥性有關(guān)。長時間使用殺蟲劑以控制過敏患者家中的蟑螂種群可能會導(dǎo)致GST表達(dá)增加和患者對環(huán)境過敏原不同程度暴露。這些治療方法對蟑螂過敏原水平的影響尚不清楚。L.Karla Arruda等人的研究顯示，殺蟲劑治療可能會增加GST過敏原的暴露，這反過來可能會導(dǎo)致過敏癥狀的風(fēng)險增加[9]。與其他昆蟲GST相反，德國小蠊GST對CDNB(1-氯-2,4二硝基苯)底物的活性很低。這意味著德國小蠊GST對CDNB以外的底物有更高的親和力(即德國小蠊GST具有不同尋常的底物特異性)，或者德國小蠊會產(chǎn)生一種比Bla g 5變應(yīng)原對CDNB特異性更高的GST同工酶。Kyoung-jin Jeong通過覆蓋Bla g 5的1-175個氨基酸的3個肽片段來確定IgE表位區(qū)域，這3個肽片段沒有表現(xiàn)出IgE反應(yīng)性。該結(jié)果表明，Blag 5的表位位于176和201之間的C端區(qū)域[10]。Kyoung-jin Jeong猜測Blag 5在C末端區(qū)域可能會產(chǎn)生類似果蠅GST的域間裂隙結(jié)構(gòu)，從而構(gòu)成構(gòu)象表位[10]。

我國臨床流行病學(xué)調(diào)查顯示蟑螂抗原皮膚點刺試驗陽性率12.7%～79%[11]，考慮到生物多樣性，不同地區(qū)的生物其基因序列和氨基酸序列有一定差異，導(dǎo)致其免疫原性有所不同，為了提高我國過敏性疾病診斷的特異性和治療療效，因盡可能使用本地化過敏原。本實驗研究的Blag5基因序列全長1 140 bp，編碼Bla g 5蛋白共計200個氨基酸，通過基因重組技術(shù)將德國小蠊主要過敏原Blag5基因?qū)氪竽c埃希氏菌，通過純化最終得到高純度的Bla g 5重組蛋白，可應(yīng)用于臨床德國小蠊過敏的特應(yīng)性診斷[11]。特異性免疫治療(SIT)是目前認(rèn)為最為有效的脫敏療法，即通過對過敏者注射過敏原，誘導(dǎo)患者產(chǎn)生過敏反應(yīng)，并逐漸增加劑量達(dá)到增強(qiáng)患者對其耐受，最終達(dá)到脫敏的目的[12]，但目前臨床上廣泛使用的仍然是蟑螂粗提液，粗提液中含大量非致敏成分，其具有特異性差、穩(wěn)定性差、治療周期長、易產(chǎn)生不良反應(yīng)等缺陷[13]，而重組Bla g 5蛋白可用于標(biāo)準(zhǔn)化疫苗生產(chǎn)，從而避免蟑螂浸出液種種缺陷[14]。本研究通過SWISS-MODLE、DNAstar等生物信息學(xué)工具對Bla g 5的三維結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、親水性、表面可及性、抗原指數(shù)等理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，為德國小蠊過敏原的結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)[13]。

利益沖突：無