馬秉楠 關(guān)玉波 陳長(zhǎng)鋒 于 洋 徐西林 張曉峰△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161000）

股骨頭壞死發(fā)病與激素、酒精、輻射、血液系統(tǒng)疾病、血管源性疾病等多種因素有關(guān)［1］。酒精性股骨頭壞死多發(fā)于中青年人群，由于乙醇過(guò)量的攝入而導(dǎo)致，與乙醇細(xì)胞毒性、脂肪代謝紊亂、骨質(zhì)疏松等多種因素有關(guān)，骨內(nèi)微循環(huán)障礙是其病理基礎(chǔ)［2］。toll樣受體4（TLR4）在多種疾病發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮啟動(dòng)炎性反應(yīng)的作用，核因子-κB（NF-κB）可通過(guò)介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)揮促凝血作用，且TLR4可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)細(xì)胞因子的合成和釋放，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）具有促進(jìn)血管生長(zhǎng)促進(jìn)局部組織供血的作用［3-4］。股骨頭壞死屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”“痰濁”“骨蝕”范疇，嗜酒無(wú)度損傷脾胃，導(dǎo)致脾失健運(yùn)，肝失疏泄，濕熱內(nèi)蘊(yùn)，痰濁郁結(jié)，瘀血阻滯［5］。治法為活血化瘀、通絡(luò)止痛、強(qiáng)腎壯骨。補(bǔ)腎生髓強(qiáng)骨方為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)聯(lián)合齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院聯(lián)合開(kāi)發(fā)的治療酒精性股骨頭壞死的經(jīng)典方劑，具有化瘀行氣、補(bǔ)肝益腎、強(qiáng)筋健骨功效，具有良好的臨床療效，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在觀察補(bǔ)腎生髓強(qiáng)骨方對(duì)酒精性股骨頭壞死模型大鼠炎癥因子、氧化應(yīng)激及TLR4、NF-κB和VEGF蛋白表達(dá)的影響，為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠，雄性，12周齡，體質(zhì)量（240±20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK（黑）2017-0009。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格號(hào)：2019110367。動(dòng)物室溫飼養(yǎng)，自然采光，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 試藥與儀器 補(bǔ)腎生髓強(qiáng)骨方：熟地黃20 g，骨碎補(bǔ)25 g，牛膝15 g，當(dāng)歸15 g，雞血藤15 g，三七10 g，紅花10 g，杜仲15 g，續(xù)斷10 g，菟絲子20 g，黃芪10 g，獨(dú)活10 g，甘草10 g。上述中藥飲片由齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，藥材加水煎煮2次，分別濃縮至1 mL含1 g原藥材的藥液。多巴絲肼片（美多芭），上海羅氏制藥有限公司；52°白酒產(chǎn)自北京紅星股份有限公司；水合氯醛購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HE染色試劑盒購(gòu)于武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和C反應(yīng)蛋白（CRP）試劑盒購(gòu)于碧云天生物科技有限公司（批號(hào)分別為 190564、191123、200046）；脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）試劑盒購(gòu)于福建邁新生物科技有限公司（批號(hào)分別為20190812、20190923、20191116）；TLR4、NF-κB和VEGF引物由上海佰力格生物技術(shù)有限公司合成，其序列見(jiàn)表1；SPARKeasy提取試劑盒、SPARKscriptⅡ RT kit、SYBR Green qPCR Mix均購(gòu)于山東思科捷生物技術(shù)有限公司（批號(hào)分別為：AC0101、AG0304、AH0104）TLR4、NF-κB和VEGF單抗購(gòu)于武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司（批號(hào)分別為20190622、20190711、20190515）；二抗購(gòu)于河北博海生物工程開(kāi)發(fā)有限公司（批號(hào)20191025）。手術(shù)器械，蘇州六六視覺(jué)醫(yī)療設(shè)備公司；BX60顯微鏡，日本Olympus Optical公司；切片機(jī)，德國(guó)萊卡公司；Neofuga23R離心機(jī)。上海力康醫(yī)療設(shè)備有限公司；EL×800酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；AU400型全自動(dòng)生化分析儀，日本OLYMPUS公司；Image-pro plus 6.0病理圖像分析系統(tǒng)，美國(guó)Motic公司。

表1 TLR4、NF-κB、VEGF及β-actin引物序列

1.3 模型制備 采用烈性白酒灌胃法誘導(dǎo)建立酒精性股骨頭壞死大鼠模型［6］。將40只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及干預(yù)組和陽(yáng)性組，每組10只。除對(duì)照組外，其余大鼠給予白酒灌胃，劑量為10 mL/kg，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃24周。對(duì)照組給予生理鹽水灌胃，劑量為10 mL/kg，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃24周。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為病理切片部分股骨頭出現(xiàn)股骨頭負(fù)重區(qū)軟骨壞死脫落。

1.4 給藥方法 于造模成功后第2天進(jìn)行藥物治療。模型組和對(duì)照組給予生理鹽水灌胃，干預(yù)組給予補(bǔ)腎生髓強(qiáng)骨湯灌胃，陽(yáng)性組給予美多芭灌胃（0.1 g/mL），劑量均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)給藥4周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）HE染色：取各組股骨頭，制成0.5 cm×0.5 cm×0.4 cm的骨塊，置10%乙二胺四乙酸的染缸中脫鈣8周，每周更換乙二胺四乙酸溶液，脫鈣后經(jīng)不同濃度乙醇脫水處理，二甲苯固定，連續(xù)切0.6 μm薄片，乙醇水化，蘇木精染色，1%鹽酸乙醇溶液分化，浸入伊紅染液，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠進(jìn)行封片，顯微鏡下觀察。2）炎癥因子檢測(cè)：眼球取血，離心，取上清，ELISA測(cè)定各組大鼠血清TNF-α、IL-6和CRP水平，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。3）氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)：生物化學(xué)法檢測(cè)LPO、MDA、SOD和GSHPX等氧化應(yīng)激指標(biāo)。乳過(guò)氧化物酶法測(cè)定LPO，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD，二硫代二硝基苯甲酸法測(cè)定GSH-PX。4）RT-PCR法檢測(cè)基因：處死各組大鼠后，取股骨頭組織，Trizol法提取總RNA，260 nm和280 nm波長(zhǎng)檢測(cè)提取的RNA純度。擴(kuò)增條件為預(yù)變性：95℃30 s，循環(huán)1次。PCR反應(yīng)：95℃，5 s，60℃，30 s，循環(huán)40次。融解曲線分析：95 ℃，15 s，60 ℃ 60 s，95℃ 15 s，循環(huán)1次。測(cè)定每組mRNA的Ct值，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量。5）免疫印記法檢測(cè)蛋白：取股骨頭切片，液氮磨組織，加入裂解液和PMSF混合液冰上裂解取上清，BCA法測(cè)定各孔吸光度，沸水浴變性蛋白，冷卻，加入SDS-PAGE膠，70 V恒壓電泳30 min。取PVDF膜，甲醇浸泡10 min，安裝閉合夾子，置轉(zhuǎn)膜槽，100 V電壓220 mA轉(zhuǎn)模2 h。將PVDF膜浸泡于5%脫脂牛奶TBST緩沖液，室溫水平搖床振搖1 h，棄去封閉液，TBST洗滌3次，加入一抗（1∶500），4℃水平搖床過(guò)夜。TBST洗滌3次，加入二抗（1∶2 000）、室溫孵育1 h，加入發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光成像儀曝光后分析條帶灰度值，用Image J軟件計(jì)算目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶的灰度比值，兩者的比值即為目的蛋白的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)比較組內(nèi)和組間差異。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組骨組織的病理學(xué)比較 與對(duì)照組比較，模型組股骨頭組織結(jié)構(gòu)紊亂，軟骨脫落，骨細(xì)胞陷窩，脂肪細(xì)胞體積增大；干預(yù)組和陽(yáng)性組股骨頭組織結(jié)構(gòu)改善，軟骨少量脫落，骨細(xì)胞陷窩減輕，脂肪細(xì)胞體積增大不明顯，且干預(yù)組優(yōu)于模型組。見(jiàn)圖1。

2.2 各組炎癥因子水平比較 見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，模型組TNF-α、IL-6和CRP水平顯著升高；與模型組比較，干預(yù)組和陽(yáng)性組血清TNF-α、IL-6和CRP水平顯著降低，且干預(yù)組低于陽(yáng)性組（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠骨組織病理切片（HE染色，200倍）

表1 各組大鼠炎癥因子水平比較（±s）

表1 各組大鼠炎癥因子水平比較（±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與陽(yáng)性組比較，▲P＜0.05。下同

組 別n TNF-α（ng/L）IL-6（ng/L）CRP（mg/L）對(duì)照組模型組干預(yù)組陽(yáng)性組10 10 10 10 21.03±2.31 37.23±3.45*24.57±2.38*△▲26.47±2.34*△69.54±4.12 93.01±3.68*75.17±3.04*△▲78.01±2.89*△5.18±0.99 9.64±1.62*6.03±1.14*△▲6.53±2.89*△

2.3 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，模型組LPO、MDA、SOD和GSH-PX水平均顯著升高；與模型組比較，干預(yù)組和陽(yáng)性組LPO、MDA水平降低，SOD和GSH-PX水平升高，且干預(yù)組優(yōu)于模型組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較（±s）

表2 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較（±s）

組別對(duì)照組模型組干預(yù)組陽(yáng)性組n 10 10 10 10 LPO（μg/L）8.23±0.61 17.34±1.32*10.35±1.15*△▲11.86±1.61*△MDA（U/L）2.31±0.28 6.42±0.37*4.39±0.42*△▲5.17±0.37*△SOD（U/L）60.14±5.23 92.31±7.36*143.48±11.34*△▲135.47±12.05*△GSH-PX（U/L）43.67±2.61 145.56±10.24*186.54±15.27*△▲171.22±15.02*△

2.4 各組mRNA基因水平比較 見(jiàn)表3。與對(duì)照組比較，模型組TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)水平升高，VEGF mRNA表達(dá)水平降低；與模型組比較，干預(yù)組和陽(yáng)性組TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)水平降低，VEGF mRNA表達(dá)水平升高，且干預(yù)組優(yōu)于陽(yáng)性組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠TLR4、NF-κB和VEGF mRNA水平比較（±s）

表3 各組大鼠TLR4、NF-κB和VEGF mRNA水平比較（±s）

組別對(duì)照組模型組干預(yù)組陽(yáng)性組n 10 10 10 10 TLR4 0.98±0.12 4.76±0.53*2.17±0.23*△▲2.51±0.29*△NF-κB 1.03±0.13 4.16±0.25*1.76±0.21*△▲2.01±0.23*△VEGF 1.15±0.09 0.47±0.05*0.87±0.09*△▲0.76±0.06*△

2.5 各組蛋白水平比較 見(jiàn)圖2，表4。與對(duì)照組比較，模型組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平升高，VEGF蛋白表達(dá)水平降低；與模型組比較，干預(yù)組和陽(yáng)性組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平降低，VEGF蛋白表達(dá)水平升高，且干預(yù)組優(yōu)于陽(yáng)性組（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠股骨頭組織中TLR4、NF-κB和VEGF蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠TLR4、NF-κB和VEGF蛋白水平比較（±s）

表4 各組大鼠TLR4、NF-κB和VEGF蛋白水平比較（±s）

組別對(duì)照組模型組干預(yù)組陽(yáng)性組n 10 10 10 10 TLR4 0.75±0.05 2.76±0.33*1.26±0.14*△1.47±0.12*△NF-κB 0.62±0.5 1.59±0.12*1.06±0.09*△1.19±0.12*△VEGF 4.36±0.31 2.86±0.25*3.95±0.35*△3.51±0.26*△

3 討 論

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，酒精濫用可誘導(dǎo)IL-6等炎癥介質(zhì)的分泌，造成免疫功能紊亂。Toll樣受體是炎癥反應(yīng)的起點(diǎn)，可影響免疫與炎癥反應(yīng)，TLR4過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致破骨細(xì)胞的大量增殖［7］。NF-κB通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)，在免疫炎性反應(yīng)等方面發(fā)揮作用，導(dǎo)致骨骼發(fā)育減弱［8］。VEGF可刺激血管生成和促進(jìn)骨形成及其改建，局部骨組織的缺氧狀態(tài)為VEGF基因發(fā)揮生物作用的關(guān)鍵誘發(fā)因素，增加VEGF的表達(dá)有助于骺軟骨的修復(fù)［9］。因此，從TLR4、NF-κB和VEGF蛋白表達(dá)水平探討酒精性股骨頭壞死的機(jī)制具有重要意義。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎陰不足，腎水虧乏，不能制火，熱伐其精，髓減則骨枯，阻塞經(jīng)絡(luò)，筋骨失養(yǎng)而發(fā)此病?，F(xiàn)代藥理研究表明，活血化瘀藥物能抑制血小板聚集、抗血栓形成、降低血液黏度［10］。補(bǔ)腎生髓強(qiáng)骨方中熟地黃可補(bǔ)肝益腎、強(qiáng)健筋骨；骨碎補(bǔ)、杜仲和續(xù)斷均可補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨；牛膝補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)壯筋骨、活血祛瘀；當(dāng)歸補(bǔ)氣和血、調(diào)經(jīng)止痛；雞血藤祛風(fēng)活血、舒筋活絡(luò)；三七止血散瘀、消腫止痛；紅花活血化瘀、通絡(luò)止痛；菟絲子補(bǔ)肝腎、益精壯陽(yáng)；黃芪補(bǔ)氣固表、利水消腫、消毒生肌；獨(dú)活祛風(fēng)除濕、痛痹止痛；甘草補(bǔ)脾益氣、調(diào)和諸藥。該方以破瘀通經(jīng)、補(bǔ)益肝腎的藥為主，輔以補(bǔ)氣血、醒脾和胃以扶正氣，佐以活血引經(jīng)的使藥，配以使藥調(diào)和諸藥，君臣佐使一起發(fā)揮止痛行氣、通經(jīng)絡(luò)、滋補(bǔ)肝腎、壯筋骨的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎生髓強(qiáng)骨方可改善股骨頭組織結(jié)構(gòu)，減少軟骨脫落，減輕骨細(xì)胞陷窩和脂肪細(xì)胞體積，降低血清TNF-α、IL-6、CRP、LPO、MDA水平，升高SOD和GSH-PX水平，降低TLR4、NF-κB基因和蛋白表達(dá)水平，升高VEGF基因和蛋白表達(dá)水平。這與方中熟地黃改善小鼠血脂代謝；骨碎補(bǔ)刺激骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代償性增生，改善軟骨細(xì)胞、推遲細(xì)胞退行性變；牛膝可通過(guò)提高血清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平促進(jìn)股骨頭壞死的修復(fù)；當(dāng)歸抑制血小板的聚集，提高纖溶酶的活性，促進(jìn)纖維蛋白溶解；雞血藤主要含有黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、三萜及甾醇等類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用；三七總皂苷能改善缺血性壞死股骨頭的成骨細(xì)胞代謝及促進(jìn)血管再生；紅花中含有紅花黃色素，該物質(zhì)可以抑制血液中血小板聚集，預(yù)防股骨頭壞死患者微血栓形成；杜仲調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫平衡；續(xù)斷促進(jìn)骨的形成作用，續(xù)斷能改善微循環(huán)，加快血腫吸收，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增生及膠原蛋白的合成等有關(guān)［11-16］。

綜上所述，補(bǔ)腎生髓強(qiáng)骨方對(duì)酒精性股骨頭壞死模型大鼠具有較好的治療作用，可減輕炎癥因子，改善氧化應(yīng)激，其機(jī)制可能與抑制TLR4、NF-κB和VEGF蛋白表達(dá)有關(guān)。