鄭之俊 肖 偉 梁發(fā)俊 章顯寶 王 震
安徽中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院腦病六科,合肥 230061
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種與衰老密切相關的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病,導致該病的因素較多,如遺傳因素、環(huán)境因素、線粒體功能障礙、氧化應激[1]、興奮性氨基酸作用等,具體發(fā)病機制尚未完全明了。其基本病理變化為黑質致密區(qū)多巴胺能神經元及其他含色素的神經元大量變性丟失、殘留的神經細胞內嗜酸性包涵體即路易小體的形成,伴有紋狀體多巴胺含量顯著減少,主要表現(xiàn)為運動遲緩、靜止性震顫、肌張力增高等[2]。目前對于PD多首選藥物治療,也有以神經核毀損術為代表的癥狀性治療,但均不能取得滿意遠期療效。本課題組基于“腸腦軸”理論選取相應穴位針刺治療PD模型大鼠,觀察其對中腦黑質TH蛋白及相關炎癥介質表達的影響,旨在探討針刺對PD治療作用及其相應作用機制。
無特定病原體(specefic pathogen free,SPF)級SD健康成年雄性大鼠40只,體重220~300 g,由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供,合格證號SCXK(皖)2017-001,于安徽中醫(yī)藥大學新安醫(yī)學重點實驗室動物房喂養(yǎng)。將大鼠隨機分為針刺組、模型組、假手術組、正常組,每組10只。
魚藤酮(Sigma公司)、DMSO(國藥集團化學試劑有限公司)、10%水合氯醛(1 g水合氯醛倒入9 g蒸餾水中配置)、兔抗鼠TH單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司,BA1051)、HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司,BA1054)、β-actin抗體(Zsbio公司,18AV0311)、ECL底物液(Thermo公司,SF249607)、丙烯酞胺(Amresco公司,Exp201609)、甲叉雙丙烯酞胺(Amresco公司,Amresc00172)、RIPA裂解液(Beyotime公司,051018180717)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所,P0010)、PVDF膜(Milipore公司,R8CA8257E)、一次性無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司,0.30 mm×13 mm)。
電泳儀(北京六一儀器廠,DYY-7C)、垂直電泳槽(北京六一儀器廠,DYCZ-24DN)、電轉儀(北京六一儀器廠,DYCZ-40)。
參照文獻[3]采用魚藤酮頸背部皮下注射法制備魚藤酮帕金森病大鼠模型,模型組和針刺組大鼠皮下注射魚藤酮溶液(1 mg/kg),假手術組皮下注射1 mg/kg 0.9%氯化鈉注射液和DMSO混合液(0.9%氯化鈉注射液:DMSO=1:7),1次/d,連續(xù)注射14 d,正常組不進行特殊干預。
造模成功標準參照文獻[4]進行判定:造模后大鼠出現(xiàn)典型的毛色變黃變臟,運動遲緩,弓背姿勢,反應遲鈍,并出現(xiàn)肌強直伴震顫,癥狀呈進行性加重等表現(xiàn),即為造模成功。
針刺組取穴為雙側“上巨虛”穴、雙側“天樞”穴及“大腸俞”穴,“上巨虛”取膝關節(jié)后外側,在腓骨頭下約10 mm處;“天樞”取大鼠的肚臍眼旁5 mm處;“大腸俞”取大鼠腰部第4腰椎棘突下旁開5 mm。造模成功后,將大鼠四肢固定于自制鼠板上,固定器固定大鼠頭部,在其清醒狀態(tài)下,常規(guī)消毒針刺部位后,針刺組大鼠采用0.3 mm×13 mm一次性無菌針灸針斜刺3 mm。每日上午進行針刺治療,20 min/次,1次/d,7 d為一個療程,一個療程結束后休息1 d,共治療2個療程。其余各組大鼠自由進食及飲水,抓取、固定時間同針刺組。
各組大鼠均進行行為學爬桿實驗[5],準備一根長60 cm、直徑3 cm的圓柱形木桿,外纏醫(yī)用膠布以保證足夠摩擦力。各組實驗大鼠安靜環(huán)境適應15 min后,實驗人員手持大鼠尾巴,將大鼠頭朝下倒立放于木桿頂端,記錄大鼠從木桿頂端爬至木桿桿底時間。大鼠不能抓緊木桿,直接掉落,記為2.0分;大鼠滑行后掉落,記為1.5分;大鼠于木桿上間歇停頓數(shù)次爬至木桿桿底,尚可抱緊,記為1分;大鼠呈螺旋狀一步一步向下爬行,兼有后肢滑行,記為0.5分;大鼠四肢并用,一次性從木桿頂端爬至木桿桿底,記為0分。
比較各組大鼠黑質區(qū)TH、p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表達,采用Western blot法進行檢測。各組大鼠經相應處理結束后,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,迅速斷頭處理,取出大腦,冰面上迅速分離黑質,于-80 ℃冰箱保存。將腦組織放于預冷的玻璃勻漿器中,加入裂解液冰浴勻漿,勻漿液于4 ℃條件下,15 000 r/min離心14 min后吸取上清液。根據蛋白分子量配置成12%的聚丙烯酞胺凝膠電泳;轉膜,轉膜條件為IL-1β 200 mA,50 min;TNF-α、IFN-γ 200 mA,60 min;TH、p-c-Jun,200 mA,90 min;封閉,用封閉液稀釋對應的一抗,將PVDF膜浸泡于一抗4 ℃溶液中孵育過夜。IL-1β、p-c-Jun、TH采用1:200的比例稀釋,TNF-α、IFN-γ采用1:800的比例稀釋;二抗,用封閉液稀釋后,用相應的HRP標記二抗按1:40 000的比例稀釋。將PVDF膜浸泡于稀釋后的二抗孵育液中,在37 ℃的溫度下?lián)u床孵育2 h;顯色曝光,放置在X線膠片中壓片,之后依次放入顯影液和定影液中顯影、定影。采用Image J軟件對蛋白條帶進行分析,以目標條帶的吸光度值與β-actin條帶吸光度值之比為TH、p-c-Jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白的相對表達量。
針刺組、模型組大鼠在注射魚藤酮后出現(xiàn)四肢肌張力增高、震顫,毛色干枯稀疏、變黃變臟及拒捕行為減弱等表現(xiàn),并逐漸加重。正常組及假手術組大鼠飲食如常,喜活動,善打斗,皮毛光滑。
正常組和假手術組大鼠均能夠一次性順利、從木桿頂端爬到木桿底。模型組、針刺組大鼠在注射魚藤酮7天后,表現(xiàn)為抱桿不穩(wěn),甚則墜落,14天后更明顯。針刺組大鼠治療后7天后,雖然爬桿實驗仍表現(xiàn)為抱桿不穩(wěn),但針刺組大鼠自發(fā)性活動增多,較治療前改善;針刺治療14天后,針刺組大鼠雖容易滑落,但能夠抱桿,較前進一步改善。
與正常組及假手術組比較,模型組大鼠TH蛋白表達明顯減少,p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表達明顯增加(P<0.05)。與模型組比較,針刺組大鼠TH蛋白表達明顯增加,p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表達明顯減少(P<0.05)。見表1。
表1 各組大鼠黑質區(qū)蛋白相對表達量比較
根據本病臨床表現(xiàn),可將其歸類于“顫證”、“痙證”等范疇?!鹅`樞·經脈》記載“胃足陽明之脈,起于鼻之交頞中……循發(fā)際,至額顱”,《靈樞·動輸》記載“胃氣上注于肺……入絡腦”,張仲景在《傷寒論》中多次提出陽明腑實證致神志變化;由此可見,胃腸與腦在經脈循行上密切相關,胃腸功能異常可導致神志疾病的發(fā)生。中醫(yī)學認為,腦神與胃腸功能密切相關,這與現(xiàn)代醫(yī)學中“腸腦軸”觀念不謀而合[6]。
“腸腦軸”為大腦與腸道之間功能整合的雙向信息交流系統(tǒng),涉及神經通路、免疫和內分泌機制[7]。唐莉莉[8]、馬盈盈[9]等基于“腸腦軸”學說采用相應中醫(yī)藥手段治療PD患者,發(fā)現(xiàn)以腸道為靶點治療PD,可減輕患者臨床癥狀,改善腸道菌群,調節(jié)血液中腦腸肽水平。因此,本研究選取針刺大腸經募穴天樞、大腸經下合穴上巨虛、大腸經背俞穴大腸俞治療PD模型大鼠,旨在基于“腸腦軸”理論,通過改善胃腸功能來治療神經系統(tǒng)疾病。
PD的典型病理特征為黑質致密區(qū)多巴胺能神經元及其他含色素的神經元大量變性丟失、殘留的神經元胞質內出現(xiàn)嗜酸性包涵體。越來越多研究[10-11]表明,神經炎癥介導的神經毒性在PD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用;通過降低炎癥因子水平,可以對PD起到一定的治療作用。有學者[12-13]認為,p-c-Jun是JNK信號通路的活性底物,與炎癥反應關系密切,并與PD發(fā)病密切相關。TH是多巴胺合成的限速酶,能夠有效預防PD等神經退行性疾病的發(fā)生,TH表達減少可導致多巴胺的損傷,從而導致PD的發(fā)生[14]。
本研究結果發(fā)現(xiàn),與正常組及假手術組比較,模型組大鼠TH蛋白表達明顯減少,p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表達明顯增加;表明帕金森病大鼠造模成功后,大鼠黑質區(qū)TH蛋白表達上調,p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表達下調。與模型組比較,針刺組大鼠TH蛋白表達明顯增加,p-c-jun、TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表達明顯減少;表明針刺治療可能通過降低p-c-jun水平,減少炎癥介質TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表達,增加帕金森大鼠黑質區(qū)TH蛋白含量,從而改善魚藤酮對PD大鼠神經元造成的損傷。與王述菊等[15]的研究結果相一致,表明針刺可能通過調節(jié)PD模型大鼠體內MAPK/JNK信號通路,降低p-c-jun在黑質區(qū)的表達,減少PD模型大鼠炎癥因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β的表達,從而對PD的發(fā)生發(fā)展可起到一定的治療作用。
綜上所述,針刺可下調PD模型大鼠黑質區(qū)JNK表達,降低炎癥因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β水平,對PD有一定的調節(jié)作用。