鄭丹妮 王夢穎 胡藝涵 劉良忠

(1. 武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2. 武漢食品化妝品檢驗所，湖北 武漢 430012)

納豆是一種由納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)發(fā)酵大豆[1-2]產(chǎn)生的具有拉絲特性[3]的發(fā)酵食品，起源于中國豆豉，于唐代傳到日本后逐漸發(fā)展成一種新型發(fā)酵食品。作為日本消費量最大的發(fā)酵食品，納豆被認(rèn)為是日本人長壽的“秘方”[4]。2002年，衛(wèi)生部將納豆芽孢桿菌發(fā)酵的納豆列為普通食品進(jìn)行管理[5]。納豆芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌的亞種[6]，其生長代謝過程中能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)[7]，且對高溫和酸性胃液有一定耐受能力和穩(wěn)定性[8-9]。除含有納豆激酶外，納豆還含有許多生理活性物質(zhì)[10-12]，如異黃酮、超氧化物歧化酶、皂苷素、生育酚、多種維生素等，使納豆兼具營養(yǎng)性和功能性[13-15]。1987年，日本學(xué)者首次提取出納豆激酶[16]，該酶具有良好的溶栓能力，能輔助治療和預(yù)防心腦血管疾病[17]。隨著中國社會老齡化的加速，心腦血管疾病逐漸成為高風(fēng)險疾病，與納豆激酶相關(guān)的保健品和食品成為了近年來的熱門研究課題[18-19]。

目前市場上的商品化納豆酶活普遍較低[20]，近年來許多研究側(cè)重于單株納豆芽孢桿菌的篩選和優(yōu)化。如利用gyrA基因序列、質(zhì)譜分析和PCR克隆基因結(jié)合的方式鑒定菌株，再結(jié)合SDS-PAGE和纖溶活性測定得到高產(chǎn)納豆激酶菌株[21]，以超聲波、超高壓、紫外誘變[22-23]等方式提高單株納豆芽孢桿菌的產(chǎn)酶能力，以進(jìn)一步提高納豆產(chǎn)品的納豆激酶活力和綜合品質(zhì)。但是，在納豆發(fā)酵過程中會產(chǎn)生比較明顯的氨臭味[24]，其中的揮發(fā)性鹽基氮與氨臭味大小具有相關(guān)性，能反映納豆的氨臭味大小[25]。

研究擬從分離純化保藏的納豆芽孢桿菌中進(jìn)一步篩選出納豆激酶活力較高的2株納豆菌，采用雙菌發(fā)酵制備納豆，以納豆激酶酶活和揮發(fā)性鹽基氮含量為評價指標(biāo)，對雙菌株發(fā)酵納豆工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高納豆激酶酶活的同時降低納豆中令人不喜的氨臭味，獲得品質(zhì)優(yōu)良的納豆產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆芽孢桿菌N1、N2、N3、N4、N5、N6：實驗室分離純化[26]后篩選保藏；

非轉(zhuǎn)基因黃豆：市售；

蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、牛肉膏、福林酚：生化試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

氫氧化鈉、氯化鈉、碳酸鈉、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、可溶性淀粉：分析純，上海展云化工有限公司；

酪氨酸：分析標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；

酪蛋白：生化試劑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

淀粉培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，可溶性淀粉2%，瓊脂2%，121 ℃滅菌20 min；

LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物0.5%、蛋白胨1%、氯化鈉1%，121 ℃滅菌20 min；

LB固體培養(yǎng)基：酵母提取物0.5%、蛋白胨1%、氯化鈉1%、瓊脂1.5%，121 ℃滅菌20 min；

酪蛋白培養(yǎng)基：A液(牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%)，121 ℃滅菌20 min；B液(干酪素2%)，115 ℃滅菌20 min，使用前A、B液混合。

1.2 主要儀器與設(shè)備

多功能臺式離心機(jī)：Frontier5000小型，奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司；

紫外—可見光分光光度計：Evolution220型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：DNP-9052型，上海精宏試驗設(shè)備有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：BXM-30R型，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；

落地式恒溫振蕩器：LHZ-111型，上海精宏試驗設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 納豆芽孢桿菌產(chǎn)酶能力篩選 使用保存菌株N1、N2、N3、N4、N5、N6劃線純化3次后，挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h活化2次，將第3代培養(yǎng)液作為發(fā)酵種子液。將種子液稀釋至合適濃度梯度取0.1 mL涂布于淀粉培養(yǎng)基和酪蛋白培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。記錄水解圈直徑與菌落直徑比值(C/H)，3次平行。

1.3.2 納豆芽孢桿菌生長曲線繪制 將活化的種子液接種至液體LB培養(yǎng)基，37 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔3 h取樣，稀釋后使用10 mm比色皿測OD660 nm值[27]，無菌LB液體培養(yǎng)基為空白對照。以時間為橫坐標(biāo)，OD660 nm值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.3.3 納豆制備 挑選無蟲洞、無裂紋、表面完整、無異色的飽滿黃豆粒，洗凈，按料液比(m納豆∶m蒸餾水)1∶4 (g/mL)加入蒸餾水浸泡24 h，瀝干，121 ℃滅菌20 min。37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h活化種子液兩代，待黃豆冷卻后，按比例加入活化種子液，充分?jǐn)噭蚝笾糜诤銣嘏囵B(yǎng)箱發(fā)酵一定時間，再于4 ℃冰箱中后熟24 h 上述操作均在無菌條件下進(jìn)行。

1.3.4 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 采用紫外—可見光分光光度法。以吸光度為縱坐標(biāo)，酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得曲線方程y=0.010 3x-0.003 8，R2=0.999 9。計算OD680 nm值為1時的酪氨酸量(μg)，即為吸光常數(shù)K，K=97，在95～100內(nèi)，試驗數(shù)據(jù)合理。

1.3.5 納豆浸提液制備 稱取適量納豆按料液比(m納豆∶m蒸餾水)1∶20 (g/mL)加入PBS緩沖液(pH 7.5)，4 ℃下浸提24 h，雙層紗布過濾，4 ℃、5 000 r/min離心20 min，上清液用于酶活分析。

1.3.6 納豆激酶酶活測定 采用福林酚法[28]測定酶活，每組重復(fù)3次。按式(1)計算酶活。

(1)

式中：

X——樣品的酶活力，U/g；

A——對應(yīng)標(biāo)曲所得樣品最終稀釋液的酶活，U/mL；

t——反應(yīng)時間，10 min；

m——納豆樣品質(zhì)量，g；

V——顯色反應(yīng)體積，4 mL；

n——稀釋倍數(shù)。

1.3.7 揮發(fā)性鹽基氮含量(TVB-N值)的測定 采用半微量定氮法。

1.3.8 雙菌發(fā)酵納豆單因素試驗

(1) 菌株質(zhì)量比對發(fā)酵納豆品質(zhì)的影響：黃豆蒸煮滅菌冷卻后，接入6%種子液，種子液中兩種菌株質(zhì)量比(mN5∶mN3)分別為10∶1，5∶1，3∶1，1∶1，1∶3，1∶5，1∶10，37 ℃發(fā)酵24 h，再放入4 ℃冰箱后熟24 h，考察種子液中兩種菌株質(zhì)量比(mN5∶mN3)對納豆激酶酶活和TVB-N值的影響。

(2) 種子液接種量對發(fā)酵納豆品質(zhì)的影響：黃豆蒸煮滅菌冷卻后，分別接入2%，4%，6%，8%，10%種子液，種子液中兩種菌株質(zhì)量比(mN5∶mN3)為1∶1，37 ℃發(fā)酵24 h，再放入4 ℃冰箱后熟24 h，考察種子液接種量對納豆激酶酶活和TVB-N值的影響。

(3) 發(fā)酵時間對發(fā)酵納豆品質(zhì)的影響：黃豆蒸煮滅菌冷卻后，接入6%種子液，種子液中兩種菌株質(zhì)量比(mN5∶mN3)為1∶1，37 ℃下分別發(fā)酵20，22，24，26，28 h，再放入4 ℃冰箱后熟24 h，考察發(fā)酵時間對納豆激酶酶活和TVB-N值的影響。

(4) 發(fā)酵溫度對發(fā)酵納豆品質(zhì)的影響：黃豆蒸煮滅菌冷卻后，接入6%種子液，種子液中兩種菌株質(zhì)量比(mN5∶mN3)為1∶1，分別于33，35，37，39，41 ℃下發(fā)酵24 h，再放入4 ℃冰箱后熟24 h，考察發(fā)酵溫度對納豆激酶酶活和TVB-N值的影響。

1.3.9 正交優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果選取因素水平，設(shè)計L9(34)正交試驗，以納豆激酶酶活為主要指標(biāo)，輔測TVB-N值，優(yōu)化雙菌株發(fā)酵納豆試驗。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Origin軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶能力篩選

由表1可知，各菌株生長過程中的產(chǎn)酶能力存在差異，淀粉培養(yǎng)基的C/H值為1～2，且最高值為(1.75±0.09)，最低值為(1.35±0.14)，說明產(chǎn)淀粉酶能力差異不顯著。酪蛋白培養(yǎng)基的C/H值差距較大，且最高值為(5.64±0.10)，最低值為(2.81±0.07)，說明產(chǎn)蛋白酶能力差異顯著，其中產(chǎn)酶能力較高的菌株為N2、N3、N4、N5。

表1 產(chǎn)酶能力篩選結(jié)果Table 1 Screening results of enzyme production capacity

2.2 菌株的生長曲線

由圖1可知，N2、N3、N4、N54株菌株各生長階段較為接近。菌株N6的指數(shù)生長期較其他菌株更早結(jié)束，12 h 后就進(jìn)入了生長穩(wěn)定期；菌株N1的指數(shù)生長期較其他菌株更為平緩；菌株N3和N5的生長活性較其他菌株更優(yōu)。

圖1 6株菌株的24 h生長曲線圖Figure 1 Growth curve of 6 strains within 24 hours

2.3 納豆芽孢桿菌的篩選

由圖2可知，菌株N1、N2、N6發(fā)酵納豆中的納豆激酶酶活較低，均未超過100 U/g，菌株N3發(fā)酵納豆中的納豆激酶酶活為(218.48±16.47) U/g，菌株N5發(fā)酵納豆中的納豆激酶酶活為(352.25±15.30) U/g，二者的酶活明顯較其他菌株更高。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 不同菌株發(fā)酵對納豆激酶活力的影響Figure 2 Effect of different strains on nattokinase activity

由圖3可知，菌株N5發(fā)酵制備納豆的TVB-N值最高，達(dá)(355.43±17.00) mg/100 g；菌株N1和N3發(fā)酵制備納豆的TVB-N值較低，分別為(216.21±11.79)，(219.40±4.92) mg/100 g，二者無顯著性差異?？紤]在提高酶活的情況下降低TVB-N值，菌株N5的TVB-N值最高，但其酶活也最高，菌株N3的TVB-N值較低且酶活較高，因此選取菌株N3和N5進(jìn)行后續(xù)混合發(fā)酵生產(chǎn)納豆試驗，以探索雙菌株發(fā)酵對納豆發(fā)酵的影響。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 不同菌株發(fā)酵對TVB-N值的影響Figure 3 Effects of different strains on the content of volatile base nitrogen

2.4 單因素試驗

2.4.1 菌株質(zhì)量比 由圖4可知，當(dāng)菌株質(zhì)量比(mN5∶mN3)為3∶1時，納豆激酶酶活達(dá)最高(404.40±14.32) U/g，相比N5單菌發(fā)酵提高了14.8%。當(dāng)菌株質(zhì)量比(mN5∶mN3)為1∶5，1∶10時，納豆激酶酶活較低，可能是因為菌株N5在混合發(fā)酵中起主要作用，菌株N3在一定比例范圍內(nèi)起協(xié)同菌株N5發(fā)酵的作用。TVB-N值隨菌株N3比例的增加而降低，最后趨于穩(wěn)定，相比菌株質(zhì)量(mN5∶mN3)比10∶1和5∶1，當(dāng)菌株質(zhì)量比(mN5∶mN3)為3∶1時，TVB-N值有較大幅度降低。說明菌株質(zhì)量比對納豆激酶酶活和TVB-N值的影響非常顯著(P<0.01)。

2.4.2 接種量 由圖5可知，納豆激酶酶活隨接種量的增加先升高后降低，接種量為8%時達(dá)到峰值[(370.28±11.49) U/g]。這可能是因為接種量較低時，菌種生長狀態(tài)不統(tǒng)一，導(dǎo)致發(fā)酵不充分；而超過最高值后，菌液易沉積在底部，且菌體快速發(fā)酵后，衰老期的菌體及其代謝產(chǎn)物堆積，阻礙了后續(xù)的發(fā)酵，影響了納豆激酶的生成。TVB-N值隨接種量的增加逐漸升高，且在接種量為10%時有較大幅度的升高。說明接種量對納豆激酶酶活和TVB-N值的影響非常顯著(P<0.01)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 菌株質(zhì)量比對發(fā)酵納豆品質(zhì)的影響Figure 4 Effects of different strain ratios on nattokinase activity

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 接種量對發(fā)酵納豆品質(zhì)的影響Figure 5 Effect of inoculation volume on nattokinase activity

2.4.3 發(fā)酵時間 由圖6可知，納豆激酶酶活隨發(fā)酵時間的增加先升高后降低，發(fā)酵24 h時達(dá)最高值[(435.02±18.66) U/g]。當(dāng)發(fā)酵時間為20 h時，納豆激酶酶活較低，可能是部分納豆菌發(fā)酵不完全，相關(guān)物質(zhì)的生成和酶促反應(yīng)仍在進(jìn)行；繼續(xù)延長發(fā)酵時間，部分納豆菌進(jìn)入衰老期，代謝產(chǎn)物增多，生長環(huán)境逐漸不利于正常代謝，酶促反應(yīng)逐漸減慢或終止。TVB-N值隨發(fā)酵時間的增加逐漸升高，且在26，28 h時差異不顯著。說明發(fā)酵時間對納豆激酶酶活和TVB-N值的影響非常顯著(P<0.01)。

2.4.4 發(fā)酵溫度 由圖7可知，納豆激酶酶活隨發(fā)酵溫度的升高先升高后降低，發(fā)酵溫度為37 ℃時達(dá)最高值[(445.02±14.71) U/g]。這可能是升高溫度能一定程度上促進(jìn)納豆菌的生長，各種代謝速率都有所提高，產(chǎn)酶能力也隨之提高。溫度過高，部分酶可能失活或活性大幅下降，因此酶促反應(yīng)速率降低；高溫也可能導(dǎo)致生長過快，代謝產(chǎn)物快速堆積影響納豆激酶合成并降低酶活。TVB-N值隨發(fā)酵溫度的升高而升高，且在39 ℃時有較大幅度的升高。說明發(fā)酵溫度對納豆激酶酶活的影響非常顯著(P <0.01)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖6 發(fā)酵時間對發(fā)酵納豆品質(zhì)的影響Figure 6 Effect of fermentation time on nattokinase activity

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖7 發(fā)酵溫度對發(fā)酵納豆品質(zhì)的影響Figure 7 Effect of fermentation temperature on nattokinase activity

2.5 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取菌株質(zhì)量比(mN5∶mN3)、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度為變量，進(jìn)行L9(34)正交試驗，試驗因素水平表見表2，正交試驗結(jié)果與分析見表3。

表2 正交試驗因素和水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

由表3可知，各因素對納豆激酶酶活的影響程度大小為A>C>D>B，最高納豆激酶酶活的試驗方案為A1B1C3D1;對揮發(fā)性鹽基氮含量的影響程度大小為D>C>B>A，最低TVB-N值的試驗方案為A2B3C1D1。

表3 正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Orthogonal test results and analysis

由表4可知，菌株質(zhì)量比對納豆激酶酶活的影響極顯著(P<0.01)，發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對納豆激酶酶活的影響顯著(P<0.05)，而接種量對納豆激酶酶活的影響不顯著。接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對TVB-N值的影響極顯著(P<0.01)，菌株質(zhì)量比對TVB-N值的影響顯著(P<0.05)。

表4 各因素對雙菌株發(fā)酵產(chǎn)納品質(zhì)的方差分析Table 4 Variance analysis of the effects of various factors on the activity of nattokinase produced by two strains

綜合考慮兩個指標(biāo)及各因素的影響顯著性，總結(jié)出較合適的試驗因素組合為A1B3C3D1，即菌株質(zhì)量比(mN5∶mN3)4∶1，接種量9%，發(fā)酵時間25 h，發(fā)酵溫度35 ℃。在此條件下，進(jìn)行3次驗證實驗，所得產(chǎn)品納豆激酶酶活為(481.84±19.65) U/g，TVB-N值為(205.21±10.68) mg/100 g。與單菌株N5發(fā)酵產(chǎn)納豆相比，雙菌發(fā)酵的酶活提高了36.8%，TVB-N值降低了42.3%，與單菌株N3發(fā)酵相比，酶活有所提高，但TVB-N值幾乎持平，說明菌株N5和N3共同發(fā)酵作用下，納豆的品質(zhì)得到了提升。

3 結(jié)論

通過篩選出產(chǎn)酶活性較高且活力較好的2株納豆芽孢桿菌，采用雙菌株共同發(fā)酵生產(chǎn)納豆，并對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，發(fā)酵納豆的最適工藝條件為菌株質(zhì)量比(mN5∶mN3)4∶1，接種量9%，發(fā)酵時間25 h，發(fā)酵溫度35 ℃。此條件下發(fā)酵的納豆揮發(fā)性鹽基氮含量為205.21 mg/100 g，與單菌發(fā)酵最高值相比降低了42.3%，納豆激酶酶活為481.84 U/g，與單菌發(fā)酵最高酶活相比提高了36.8%。TVB-N值仍存在繼續(xù)降低的可能性，針對這一問題，后續(xù)可添加多種食品發(fā)酵常用菌，如酵母、毛霉菌等進(jìn)行兩種以上菌株混合發(fā)酵，更高質(zhì)量地優(yōu)化納豆發(fā)酵工藝。