程天德 謝慶彤 游麗君

(1. 清遠(yuǎn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品藥品學(xué)院，廣東 清遠(yuǎn) 511510；2. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

大果山楂是一種有著悠久歷史的藥食兩用水果，與中國(guó)傳統(tǒng)中藥山楂具有相似的成分和功效，在歐洲、中國(guó)和美國(guó)等地均有種植，已被證實(shí)具有抗氧化和降血脂等功效[1-3]。大果山楂既可鮮食，也可加工成山楂粉、山楂果脯、山楂干、山楂餅、山楂酒、山楂醋、山楂罐頭等[4-6]。雖然大果山楂具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但由于大果山楂的味道酸澀，山楂干、山楂餅等粗加工產(chǎn)品難以被消費(fèi)者廣泛接受，因此需要研究可以改善大果山楂風(fēng)味的深加工技術(shù)。楊靜云等[7]研究了山楂固態(tài)發(fā)酵工藝，王彥安[8]研究了山楂果醋發(fā)酵工藝，張巧等[9-10]研究了大果山楂酵素發(fā)酵工藝，上述研究結(jié)果均表明大果山楂經(jīng)發(fā)酵處理后風(fēng)味得到了改善，但由于其采用的是固態(tài)發(fā)酵工藝和自然菌種發(fā)酵，加工過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，且沒(méi)有對(duì)能夠體現(xiàn)大果山楂主要功效的抗氧化能力進(jìn)行系統(tǒng)研究，不利于產(chǎn)品的功能性評(píng)價(jià)。為了深入研究大果山楂液體深層發(fā)酵工藝，得到質(zhì)量穩(wěn)定、總體抗氧化能力強(qiáng)的大果山楂發(fā)酵液，研究擬采用主成分分析法構(gòu)建大果山楂發(fā)酵液抗氧化能力綜合評(píng)價(jià)模型，以大果山楂發(fā)酵液的綜合抗氧化能力值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化高抗氧化活性大果山楂發(fā)酵液的發(fā)酵工藝條件，旨在為大果山楂抗氧化類功能食品的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大果山楂

采摘于廣東省連山縣某大果山楂種植基地(2019年10月)，鮮大果山楂采摘后于4 ℃冰箱中保存待用。

1.2 主要試劑

鼠李糖乳桿菌(CBS98073)：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

福林酚試劑、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)：分析純，美國(guó)Sigma公司；

沒(méi)食子酸、兒茶素、維生素E水溶性類似物(Trolox)：標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司；

熊果酸、抗壞血酸：標(biāo)準(zhǔn)品，上海純晶生化科技股份有限公司；

四氯對(duì)苯醌、硼氫化鈉：分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 主要儀器

高速組織搗碎機(jī)：DS-1型，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；

高壓滅菌鍋：LDZF-100L-III型，上海申安醫(yī)療器械廠；

多功能提取濃縮機(jī)組：EC-02A型，杭州恩創(chuàng)機(jī)械有限公司；

發(fā)酵罐：ZY-800型，上海紫裕生物科技有限公司；

離心機(jī)：TGL-20M型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；

分光光度計(jì)：UV1800型，上海菁華科技儀器有限公司；

氮吹儀：PGG-01G型，天津艾維歐科技發(fā)展有限公司；

旋渦混合儀：MS1型，德國(guó)IKA公司；

多功能酶標(biāo)儀：Filter Max F型，美國(guó)Molecular公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種活化培養(yǎng) 鼠李糖乳桿菌于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，試?yàn)前將鼠李糖乳桿菌接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中活化傳代，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)液于4 ℃、4 500 r/min 離心20 min，收集菌體，用0.85%的生理鹽水洗滌2次，混勻制成菌懸液(>109CFU/mL)供后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.4.2 發(fā)酵工藝

(1) 工藝流程：

大果山楂→洗凈→去核→打漿→調(diào)配→滅菌→接種→發(fā)酵→離心→大果山楂發(fā)酵液

(2) 操作要點(diǎn)：選取設(shè)定量的大果山楂清洗晾干，去核去梗打漿后置于60 L 0.2%的抗壞血酸溶液中護(hù)色，加入2.5 kg白砂糖混合均勻后轉(zhuǎn)移至100 L發(fā)酵罐中，121 ℃ 滅菌20 min，冷卻至室溫，用2 mol/L的HCl(或NaOH)溶液調(diào)節(jié)pH至設(shè)定值，接入設(shè)定量的鼠李糖乳桿菌(LGG)菌懸液，于設(shè)定溫度下進(jìn)行發(fā)酵。

1.4.3 指標(biāo)測(cè)定

(1) 總酚含量：采用Folin-Ciocalteu比色法[11]，分別采用50，100，150，200，250，300 μg/mL的沒(méi)食子酸溶液在760 nm下制作沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為y=0.376x+0.032，R2=0.999 2。

(2) 總黃酮含量：采用硼氫化鈉—四氯苯醌(SBC)比色法[12]，分別采用0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 mg/mL 的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液在490 nm下制作兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為y=0.481 7x+0.005 3，R2=0.998 9。

(3) 總?cè)坪浚簠⒄誎hishova等[13]的方法進(jìn)行測(cè)定，分別采用10，20，30，40，50 μg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在548 nm下制作熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為y=0.011 2x+0.056，R2=0.995 6。

(4) 氧自由基吸收能力(ORAC)：參照Wen等[14]的方法進(jìn)行測(cè)定，以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次取平均值。樣品的ORAC值表示為每克大果山楂干重的Trolox當(dāng)量(μmol TE/g DW)。

(5) 過(guò)氧自由基清除能力(PSC)：參照Adom等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定，以現(xiàn)配的抗壞血酸(VC)和沒(méi)食子酸(GA)為抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以磷酸緩沖溶液代替抗氧化物質(zhì)進(jìn)行空白試驗(yàn)，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次取平均值。樣品的PSC值表示為每克大果山楂干重的VC當(dāng)量(μmol VCE/g DW)。

(6) DPPH自由基(DPPH·)清除率：參照Blois[16]的方法進(jìn)行測(cè)定，將待測(cè)樣品溶液與2×10-4mol/L的DPPH溶液等體積混合，室溫下靜置30 min，以蒸餾水作為參比，于517 nm下測(cè)定吸光度，通過(guò)計(jì)算得出DPPH自由基清除率。

(7) ABTS自由基(ABTS+·)清除率：參照王存堂等[17]的方法進(jìn)行測(cè)定，取5 mL 7×10-3mol/L的ABTS，加入8.8 μL 1.4 mol/L的K2S2O8，充分混合后靜置16 h即得ABTS工作液。分別取50 μL待測(cè)液(相同濃度發(fā)酵液)和5 mL ABTS工作液于試管中，搖勻靜置10 min后于734 nm處測(cè)定吸光度，以不加樣品的ABTS工作液作為參比，平行測(cè)定3次取平均值，通過(guò)計(jì)算得出ABTS自由基清除率。

1.4.4 抗氧化能力綜合評(píng)價(jià)模型的建立 按20 g/100 mL發(fā)酵液的大果山楂添加量、5 mL/100 mL發(fā)酵液的LGG接種量，在25 ℃、初始pH 6.0的條件下發(fā)酵56 d，每7 d取樣一次，4 500 r/min離心10 min，取上清液檢測(cè)其總黃酮含量、總酚含量、總?cè)坪?、ORAC、PSC、DPPH·和ABTS+·清除能力。參照程天德等[18]的方法進(jìn)行主成分分析，構(gòu)建大果山楂發(fā)酵液抗氧化能力綜合評(píng)價(jià)模型。

1.4.5 單因素試驗(yàn)

(1) 大果山楂添加量對(duì)發(fā)酵液抗氧化活性的影響：在25 ℃、初始pH 6.0、LGG接種量5 mL/100 mL發(fā)酵液的條件下，分別按5，10，15，20，25 g/100 mL發(fā)酵液的量添加大果山楂。

(2) LGG接種量對(duì)發(fā)酵液抗氧化活性的影響：在25 ℃、初始pH 6.0、大果山楂添加量20 g/100 mL發(fā)酵液的條件下，分別按1，3，5，7，9 mL/100 mL發(fā)酵液的濃度接種LGG菌懸液。

(3) 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液抗氧化活性的影響：在20 g/100 mL 發(fā)酵液的大果山楂添加量、5 mL/100 mL發(fā)酵液的LGG接種量、初始pH 6.0的條件下，分別在15，20，25，30，35 ℃下進(jìn)行發(fā)酵。

(4) 初始pH對(duì)發(fā)酵液抗氧化活性的影響：在25 ℃、20 g/100 mL發(fā)酵液的大果山楂添加量、5 mL/100 mL發(fā)酵液的LGG接種量的條件下，分別以pH 2.0，3.0，4.0，5.0，6.0的初始pH進(jìn)行發(fā)酵。

每組樣品均發(fā)酵56 d，每7 d取樣一次，4 500 r/min離心10 min，取上清液檢測(cè)其總黃酮含量、總酚含量、總?cè)坪?、ORAC、PSC、DPPH·清除率和ABTS+·清除率，采用大果山楂發(fā)酵液抗氧化能力綜合評(píng)價(jià)模型計(jì)算出發(fā)酵液的抗氧化能力綜合評(píng)價(jià)得分。

1.4.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以大果山楂添加量、LGG接種量、發(fā)酵溫度和初始pH為主要影響因素，以發(fā)酵液的抗氧化能力綜合評(píng)價(jià)得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，確定最優(yōu)的高抗氧化活性大果山楂發(fā)酵液發(fā)酵工藝條件。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，各組試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均以平均數(shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化能力綜合評(píng)價(jià)模型

2.1.1 抗氧化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 大果山楂發(fā)酵液中主要抗氧化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如表1所示。由表1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚、總黃酮和總?cè)坪慷加胁煌潭鹊奶岣?，發(fā)酵液的ORAC、PSC、DPPH·清除率和ABTS+·清除率也隨之提高，說(shuō)明在試驗(yàn)設(shè)定的發(fā)酵期限內(nèi)，大果山楂發(fā)酵液的抗氧化能力有所提高。

表1 大果山楂發(fā)酵液主要抗氧化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 1 Test results of main antioxidant indexes of Malus doumeri fruits fermented beverage

2.1.2 抗氧化指標(biāo)統(tǒng)計(jì)分析 大果山楂發(fā)酵液的抗氧化指標(biāo)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表2所示。由表2可知，ABTS+·清除率、DPPH·清除率和總黃酮含量3個(gè)指標(biāo)的變異系數(shù)較高，分別達(dá)到26.67%，16.30%，13.39%，其他指標(biāo)的變異系數(shù)均低于5%。

表2 大果山楂發(fā)酵液的抗氧化指標(biāo)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果?Table 2 Statistical analysis results of antioxidant index of Malus doumeri fruits fermented beverage

2.1.3 抗氧化能力綜合評(píng)價(jià)的主成分分析 為了消除7種抗氧化指標(biāo)之間的量綱和數(shù)量級(jí)差異，采用標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)化法對(duì)各指標(biāo)的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，即：

(1)

式中：

k——該指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化值；

X——該指標(biāo)的測(cè)定值；

b——該指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。

從表3可以看出，前3個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率已經(jīng)達(dá)到82.36%，基本涵蓋了7項(xiàng)主要抗氧化指標(biāo)的數(shù)據(jù)信息，達(dá)到了提取主成分因子的標(biāo)準(zhǔn)，因此選取前3個(gè)主成分。

表3 特征值與方差貢獻(xiàn)率Table 3 Contribution rate of characteristic value and variance

2.1.4 抗氧化能力綜合評(píng)價(jià)模型 由表4可知，決定第1主成分的主要是總黃酮含量、PSC和DPPH·清除率，決定第2主成分的主要是總酚含量、ORAC、PSC和DPPH·清除率，決定第3主成分的主要是總?cè)坪?、ABTS+·清除率和DPPH·清除率，推測(cè)可能是因?yàn)橹笜?biāo)之間的相關(guān)性比較高，這些指標(biāo)才會(huì)出現(xiàn)在同一主成分中。

根據(jù)表4中主成分的特征向量，可將3個(gè)主成分分別表示為：

表4 主成分的特征向量?Table 4 Eigenvectors of principal components

第1主成分：F1=-0.132X1+0.723X2+0.032X3-0.187X4+0.626X5+0.586X6+0.118X7；

(2)

第2主成分：F2=0.825X1-0.154X2+0.065X3+0.752X4+0.536X5+0.605X6+0.018X7；

(3)

第3主成分：F3=-0.086X1+0.118X2+0.776X3+0.107X4+0.124X5+0.596X6+0.645X7。

(4)

大果山楂發(fā)酵液的綜合抗氧化能力值：

F綜合=1.214 2×(0.386 2F1+0.241 2F2+0.196 2F3)。

(5)

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 大果山楂添加量對(duì)發(fā)酵液抗氧化活性的影響 由圖1可知，發(fā)酵前期，大果山楂發(fā)酵液的抗氧化活性逐漸提高，尤其是0～21 d，提高的幅度尤為明顯，可能是由于細(xì)胞破裂，大果山楂中的主要活性成分不斷溶出造成的，也有可能是由于原本的大分子物質(zhì)被分解成小分子，從而在檢測(cè)結(jié)果上顯示出含量增加的現(xiàn)象[19]。發(fā)酵后期，這些活性成分含量出現(xiàn)了小幅下降，可能是由于被氧化或被降解造成的。發(fā)酵液的抗氧化能力隨大果山楂添加量的增加而增強(qiáng)，這種現(xiàn)象在5～20 g/100 mL發(fā)酵液的大果山楂添加量組中比較明顯，但在20～25 g/100 mL發(fā)酵液的大果山楂添加量組中不顯著，綜合考慮，擬采用20 g/100 mL發(fā)酵液左右的大果山楂添加量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 大果山楂添加量對(duì)大果山楂發(fā)酵液抗氧化活性的影響

2.2.2 LGG接種量對(duì)發(fā)酵液抗氧化活性的影響 由圖2可知，發(fā)酵初期，LGG接種量大的試驗(yàn)組抗氧化能力值較大，但發(fā)酵后期這種差異不明顯，LGG接種量5～9 mL/100 mL 發(fā)酵液試驗(yàn)組的變化曲線基本重合，說(shuō)明過(guò)多的LGG接種量對(duì)大果山楂發(fā)酵液的抗氧化能力影響有限，因此選擇5 mL/100 mL 發(fā)酵液左右的LGG接種量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 LGG接種量對(duì)大果山楂發(fā)酵液抗氧化活性的影響

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液抗氧化活性的影響 由圖3可知，25 ℃和30 ℃試驗(yàn)組的抗氧化能力值顯著高于其他試驗(yàn)組，且在第0～28天這兩組的抗氧化能力值變化曲線幾乎重合，28 d之后25 ℃試驗(yàn)組的抗氧化能力值超過(guò)了30 ℃試驗(yàn)組，因此考慮在25 ℃左右進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)大果山楂發(fā)酵液抗氧化活性的影響

2.2.4 起始pH對(duì)發(fā)酵液抗氧化活性的影響 由圖4可知，起始pH 4.0，5.0，6.0試驗(yàn)組的抗氧化能力值明顯高于其他試驗(yàn)組，且這3組的抗氧化能力值出現(xiàn)了交替領(lǐng)先的現(xiàn)象，因此考慮在起始pH 5.0左右進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 起始pH對(duì)大果山楂發(fā)酵液抗氧化活性的影響

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，得出了響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平，即大果山楂添加量15～25 g/100 mL發(fā)酵液、LGG接種量3～7 mL/100 mL發(fā)酵液、起始pH 4.0～6.0、發(fā)酵溫度20～30 ℃，各試驗(yàn)組大果山楂發(fā)酵液的抗氧化能力值在第0～28天增速較快，之后增幅逐漸放緩，從工業(yè)化生產(chǎn)的效率和效益方面考慮，發(fā)酵時(shí)間確定為28 d。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面模型的建立 以單因素試驗(yàn)為依據(jù)，設(shè)計(jì)大果山楂發(fā)酵的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平，如表5所示。

表5 大果山楂發(fā)酵的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表

2.3.2 試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 大果山楂發(fā)酵的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

表6 大果山楂發(fā)酵的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

由表7可知，模型的P值<0.000 1，說(shuō)明回歸性極顯著，結(jié)果可信。失擬項(xiàng)P值(0.927 5)>0.05，說(shuō)明模型的相對(duì)誤差較小，能夠較好地預(yù)測(cè)分析大果山楂發(fā)酵工藝。因素A、C和D對(duì)結(jié)果有顯著性影響，因素B對(duì)結(jié)果的影響不顯著，各因素對(duì)大果山楂發(fā)酵液抗氧化能力影響的大小順序?yàn)椋篈>D>C>B。采用Design-Expert 8.0軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，將大果山楂發(fā)酵液抗氧化能力綜合評(píng)分的分值設(shè)置得盡可能大，得出最佳發(fā)酵工藝：起始pH 5.10、LGG接種量5.05 mL/100 mL發(fā)酵液、大果山楂添加量20.15 g/100 mL發(fā)酵液、發(fā)酵溫度29.83 ℃，此時(shí)預(yù)測(cè)的大果山楂發(fā)酵液抗氧化能力綜合評(píng)分為3.46分。為了方便操作，在起始pH 5. 0、LGG接種量5 mL/100 mL 發(fā)酵液、大果山楂添加量20 g/100 mL發(fā)酵液、30.0 ℃條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵時(shí)間均為28 d，所得結(jié)果的平均值為3.42分，與理論值3.46分無(wú)顯著性差異，表明該預(yù)測(cè)模型科學(xué)可行。

表7 大果山楂發(fā)酵的響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果?Table 7 The results of analysis of variance of response surface test of Malus doumeri fruits fermentation

3 結(jié)論

(1) 大果山楂發(fā)酵液的抗氧化能力評(píng)價(jià)模型為：F綜合=1.214 2×(0.386 2F1+0.241 2F2+0.196 2F3)，高抗氧化活性大果山楂發(fā)酵液的最佳發(fā)酵工藝為：起始pH 5.0，發(fā)酵溫度30 ℃，大果山楂添加量20 g/100 mL發(fā)酵液、鼠李糖乳桿菌接種量5 mL/100 mL發(fā)酵液、發(fā)酵時(shí)間28 d，該工藝所得大果山楂發(fā)酵液的F綜合=3.42。

(2) 試驗(yàn)采用主成分分析法對(duì)可能影響大果山楂發(fā)酵液抗氧化活性的7項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了分析，構(gòu)建了大果山楂發(fā)酵液抗氧化能力的綜合評(píng)價(jià)模型，該模型中的3個(gè)主成分分別反映了大果山楂發(fā)酵液中不同成分對(duì)抗氧化能力的貢獻(xiàn)，雖然DPPH·清除率與大果山楂發(fā)酵液中的主要活性成分(總黃酮、總酚、總?cè)?都有關(guān)聯(lián)，但其與總黃酮、總?cè)坪康年P(guān)聯(lián)度更高，說(shuō)明僅用DPPH·清除率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)無(wú)法準(zhǔn)確地反映大果山楂發(fā)酵液中總酚及其他成分對(duì)總抗氧化能力的貢獻(xiàn)。

(3) 大果山楂發(fā)酵液中的活性物質(zhì)含量決定其抗氧化能力，試驗(yàn)測(cè)定的是總黃酮、總酚和總?cè)?類物質(zhì)的含量，但具體是這3類物質(zhì)中的哪些化合物對(duì)大果山楂發(fā)酵液的抗氧化能力起主導(dǎo)作用，目前還不清楚，后續(xù)計(jì)劃通過(guò)HPLC法鑒定大果山楂發(fā)酵液中的各種化合物，明確各活性物質(zhì)對(duì)其抗氧化能力的具體影響。