劉 麗 郇延軍 刁欣悅 馬 菲

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

苦腸俗稱腸皮，是豬小腸洗凈刮掉內(nèi)層油脂、黏膜，取其最外層而得到的具有韌性的一層皮，是豬小腸加工腸衣、肝素鈉的副產(chǎn)品，營養(yǎng)豐富，口感勁道，回味苦，是一種高蛋白低脂肪食物，一般用作炒菜、制作苦腸卷等，其具有獨特的風(fēng)味?？嗄c的營養(yǎng)價值很高，含有豐富的膠原蛋白。膠原蛋白是一種天然高分子功能性蛋白[1]，在人體皮膚中，可與水結(jié)合，能夠保水保濕，使皮膚富有彈性，有利于上皮角細(xì)胞的增生修復(fù)，延緩皮膚的衰老[2-4]，因此，膠原蛋白作為促進(jìn)組織愈合的傷口敷料[5]、可降解或可食性膠原膜[6]、保健食品等被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健、食品及美容產(chǎn)品等領(lǐng)域[7-8]。苦腸脂肪含量較低，因此在食用時感覺不太肥膩，隨著生活質(zhì)量的不斷提高，人們對于健康的飲食愈發(fā)重視，也越來越青睞低脂食品，苦腸的低脂肪含量，使其具有較高的食用價值及巨大的市場潛力。

苦腸中產(chǎn)生苦味的主要成分是膽汁酸。豬小腸在消化吸收時所產(chǎn)生的消化液中含有膽汁，膽汁是由肝細(xì)胞產(chǎn)生的具有苦味的有色液體，能促進(jìn)脂肪消化，其主要的苦味成分是膽汁酸[9]。膽汁酸隨膽汁流入腸道后約有95%被腸壁重新吸收，進(jìn)行膽汁酸的肝腸循環(huán)[10-11]。由于膽汁酸無法完全被吸收，導(dǎo)致豬小腸中含有殘留的膽汁而使豬小腸苦味明顯，嚴(yán)重影響豬小腸及其加工產(chǎn)品的食用口感。

目前關(guān)于食物苦味的脫除方法有：酶法[12]、包埋法[13-14]、微生物發(fā)酵法[15-17]、超聲法[18]、吸附法[19]等。膽汁中產(chǎn)生苦味的主要成分是膽汁酸，難溶于水，難以用水洗凈。目前對于苦腸中苦味物質(zhì)的脫除方法，國內(nèi)外并未見相關(guān)報道。針對苦腸中的苦味成分膽汁酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，研究擬從分子水平進(jìn)行探討，利用小蘇打、蘇打與膽汁酸發(fā)生反應(yīng)以及膠原蛋白在堿性條件下的溶脹作用，通過單因素試驗和Box-Behnken 響應(yīng)面分析探索小蘇打和蘇打添加量、作用時間、作用溫度對苦腸脫苦效果的影響，旨在優(yōu)化得出適宜于生產(chǎn)推廣的苦腸堿法脫苦最優(yōu)工藝條件，以期為苦腸的綜合利用提供參考，進(jìn)一步指導(dǎo)生產(chǎn)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦腸：南通天龍畜產(chǎn)品有限公司；

小蘇打、蘇打：食品級，吉林省杞參食品有限公司；

豬總膽汁酸試劑盒：武漢純度生物公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

恒溫水浴鍋：HH-S型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

離心機：SIGMA2-16K型，德國西格瑪公司；

酶標(biāo)儀：BioTek Synergyh1型，美國Biotek公司；

智能生化培養(yǎng)箱：SPX型，南京金恒實驗儀器廠；

均質(zhì)器：VOSHIN-600R型，無錫沃信儀器有限公司；

掃描電子顯微鏡：su1510型，日本日立株式會社。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備 挑選苦腸原料，剔除可見的脂肪、黏沫等雜質(zhì)，用水清洗至水澄清，瀝干水分，切成1～2 cm的小段，準(zhǔn)確稱取20 g苦腸，按照一定比例添加小蘇打或蘇打揉搓混勻，在一定溫度下脫苦處理一定時間后，用清水按照腸水比(m苦腸∶V水)1∶5 (g/mL)的比例進(jìn)行揉搓，沖洗5次，以去除多余的小蘇打或蘇打，瀝干后即得待測的苦腸樣品。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

(1) 小蘇打添加量：分別取小蘇打添加量為1%，2%，3%，4%，5%，6%，在作用時間50 min，作用溫度20 ℃ 的條件下進(jìn)行脫苦處理，以膽汁酸脫除率和苦味值為評價指標(biāo)，研究小蘇打添加量對脫苦效果的影響。

蘇打添加量：分別取蘇打添加量為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，在作用時間50 min，作用溫度20 ℃的條件下進(jìn)行脫苦處理，以膽汁酸脫除率和苦味值為評價指標(biāo)，研究蘇打添加量對脫苦效果的影響。

(2) 小蘇打作用時間：在小蘇打添加量為5%，作用溫度為20 ℃的條件下，分別作用10，20，30，40，50，60 min，以膽汁酸脫除率和苦味值為評價指標(biāo)，研究小蘇打作用時間對脫苦效果的影響。

(3) 小蘇打作用溫度：選擇作用溫度10，20，30，40，50，60 ℃，小蘇打添加量為5%，作用時間為50 min，以膽汁酸脫苦率和苦味值為評價指標(biāo)，研究小蘇打作用溫度對脫苦效果的影響。

1.3.3 響應(yīng)面分析試驗 根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，以添加量、作用時間和作用溫度為自變量，以膽汁酸脫除率和苦味值為響應(yīng)值，對苦腸的脫苦工藝進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行驗證實驗。

1.3.4 相關(guān)指標(biāo)的測定

(1) 膽汁酸含量：采用ELISE酶聯(lián)免疫法[20]。測得膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.089 6X+0.011 9，R2=0.999。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 1 Standard curve

膽汁酸脫苦率計算公式為：

(1)

式中：

D——脫苦率，%；

C0——苦腸中膽汁酸含量，μmol/g；

C1——脫苦后苦腸中膽汁酸含量，μmol/g。

(2) 感官評定：挑選10名(5男5女)經(jīng)過培訓(xùn)的人員組成評定小組，嚴(yán)格根據(jù)表1感官評定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行脫苦前后苦腸的感官評價，以100分記。

表1 感官評定標(biāo)準(zhǔn)表Table1 The sensory evaluation standard

(3) 微觀結(jié)構(gòu)：參照Birna等[21]的方法。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 每個試驗設(shè)3個平行，結(jié)果取平均值。采用Design-expert 8.0.6統(tǒng)計軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗結(jié)果分析。采用OriginPro 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 添加量對脫苦率和苦味值的影響 由圖2、3可以看出，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)增加小蘇打、蘇打的添加量時，會使得脫苦率發(fā)生改變，并呈增大的趨勢，但是添加小蘇打、蘇打達(dá)到一定的值時，脫苦率達(dá)到最大，之后隨著小蘇打、蘇打添加量的增多，脫苦率呈下降趨勢。感官評定表明，當(dāng)小蘇打添加量為4%、蘇打添加量為0.2%時，苦腸苦味較淡；繼續(xù)增加小蘇打、蘇打添加量，苦腸的苦味逐漸增加。隨著小蘇打、蘇打的添加，酸堿發(fā)生反應(yīng)，使得脫苦率下降，苦味值降低，當(dāng)堿添加過多，可能由于膠原蛋白變性形成凝膠，抑制了分子流動速率，反應(yīng)速度下降，導(dǎo)致脫苦率下降，苦味值上升。綜合考慮脫苦率和感官評定結(jié)果，選擇小蘇打的添加量為3%～5%進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 小蘇打添加量對脫苦率和苦味值的影響Figure 2 Effect of the amount of baking soda on debittering rate and bitterness value

圖3 蘇打添加量對脫苦率和苦味值的影響Figure 3 Effect of the amount of soda on debittering rate and bitterness value

2.1.2 作用時間對脫苦率和苦味值的影響 由圖4可知，小蘇打?qū)嗄c中膽汁酸的脫除率隨堿作用時間的延長而逐漸改變。膽汁酸的脫除率隨時間的延長而逐漸增加，當(dāng)作用時間達(dá)到一定值時，膽汁酸的脫除率隨時間的延長而趨于穩(wěn)定。感官評定表明，當(dāng)小蘇打作用時間達(dá)到40 min時，品嘗脫苦后的苦腸口感上已無明顯苦味。作用時間過短，堿與膽汁酸無法充分反應(yīng)，達(dá)到最佳的脫苦效果，當(dāng)反應(yīng)充分后，繼續(xù)增加時間，其反應(yīng)不再進(jìn)行，脫苦率、感官評定也趨于穩(wěn)定。綜合考慮脫苦率和感官評定結(jié)果，確定以30～50 min作為脫苦作用時間進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 小蘇打作用時間對脫苦率和苦味值的影響Figure 4 Effect of baking soda action time on debittering rate and bitterness value

2.1.3 作用溫度對脫苦率和苦味值的影響 由圖5可知，當(dāng)作用溫度低時，苦腸中膽汁酸的脫除率隨溫度的增加而逐漸增加，當(dāng)溫度大于一定值后，脫除率出現(xiàn)下降的趨勢。感官評定表明，當(dāng)小蘇打作用溫度達(dá)到40 ℃時，品嘗脫苦后的苦腸苦味較淡，但隨著作用溫度的增加，苦腸的苦味逐漸增加。這可能是由于隨著溫度的升高，反應(yīng)速度逐漸增大，脫苦率逐漸增大，溫度繼續(xù)升高，蛋白質(zhì)受熱發(fā)生變性，螺旋結(jié)構(gòu)逐漸打開成鏈，蛋白質(zhì)分子之間的交聯(lián)度增加，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，抑制了反應(yīng)的進(jìn)行[22]。綜合考慮脫苦率和感官評定結(jié)果，確定以30～50 ℃的作用溫度進(jìn)行后續(xù)研究。

圖5 小蘇打作用溫度對脫苦率和苦味值的影響Figure 5 Effect of baking soda temperature on debittering rate and bitterness value

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 苦腸脫苦工藝參數(shù)優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以脫苦率和感官評分為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，設(shè)計因素水平如表2所示，試驗設(shè)計及結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

表2 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface methodology

2.2.2 模型方差分析 通過軟件分析得到脫苦率的回歸方程為：

Y1=40.23-1.29A+2.52B-0.057C+0.77AB-2.13AC-1.13BC-4.81A2-3.74B2-3.98C2。

(2)

苦味值的回歸方程為：

Y2=17.56+1.74A-13.37B-0.94C-1.31AB+3.67AC-2.10BC+7.18A2+9.57B2+11.51C2。

(3)

由表4、5可知，脫苦率、苦味值2個模型P值均小于0.01，故該試驗方案采用的二次多項模型有著極高的顯著性；各模型失擬項P值分別為0.861 3和0.052 9，表明其結(jié)果不顯著，有較好的模型擬合度；各模型的R2均接近1，表明試驗數(shù)據(jù)與模型有良好的擬合度[23]，可以用回歸方程表達(dá)真實值進(jìn)行分析[24]。

表4 回歸模型方差分析(以脫苦率為響應(yīng)值)?Table 4 Variance analysis of the regression model (Debittering rate as response value)

2.2.3 響應(yīng)曲面分析

(1) 脫苦率響應(yīng)面分析：由圖6可知，添加量、作用溫度和作用時間對脫苦率影響較為明顯，交互項AB、AC、BC對脫苦率的影響均極顯著(P<0.01)。

圖6 三因素對脫苦率影響的響應(yīng)曲面Figure 6 Effect of three factors on the response surface of debittering rate

(2) 感官評定響應(yīng)面分析：由圖7可知，添加量、作用溫度和作用時間對苦味值影響較為明顯，交互項AC、BC對苦味值的影響極顯著(P<0.01)，交互項BC對苦味值的影響顯著(P<0.05)。

圖7 三因素對感官評定影響的響應(yīng)曲面Figure 7 Effect of three factors on the response surface of sensory evaluation

2.2.4 最佳工藝參數(shù)的優(yōu)化及驗證 綜合脫苦率和苦味值參考指標(biāo)，通過Design-expert 8.0.6軟件確定最終的脫苦參數(shù)為：小蘇打添加量3.91%，作用時間40.2 min，作用溫度45 ℃?？紤]到實際生產(chǎn)，將參數(shù)修整為小蘇打添加量4%，作用時間40 min，作用溫度40 ℃。采用上述參數(shù)進(jìn)行3次驗證實驗，其平均脫苦率為40.47%，感官評定為14.03。進(jìn)而證明響應(yīng)面優(yōu)化模型預(yù)測值較為可靠。

表5 回歸模型方差分析(以感官評定為響應(yīng)值)?Table 5 Variance analysis of the regression model (Sensory evaluation as response value)

2.3 脫苦處理對苦腸成分的影響

從表6可以看出，苦腸經(jīng)堿法脫苦處理，水分含量由80.74%上升到84.19%，蛋白質(zhì)、膠原蛋白、脂肪含量略有下降，因此苦腸的堿法脫苦對苦腸成分的影響不大。

表6 脫苦前后苦腸成分的變化Table 6 Changes in the composition of bitter intestines before and after debittering %

2.4 脫苦處理對苦腸微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖8可知，未處理的苦腸纖維緊密嚴(yán)實，表面平整光滑，沒有裂縫和空洞。經(jīng)小蘇打脫苦處理后肌原纖維出現(xiàn)變化，纖維之間空洞變大，肌束膜溶解，肌纖維出現(xiàn)了斷裂，空間和結(jié)構(gòu)變得疏松，肌束變得更加混亂[25]。

圖8 脫苦處理對苦腸微觀結(jié)構(gòu)的影響

3 結(jié)論

通過單因素試驗研究了小蘇打和蘇打?qū)嗄c脫苦效果的影響，通過響應(yīng)面分析確定了小蘇打?qū)嗄c的最佳脫苦工藝條件為：小蘇打添加量4%，作用時間40 min，作用溫度40 ℃，此條件下苦腸脫苦率達(dá)40.47%，苦味值由89.16降低到14.03。經(jīng)過優(yōu)選的脫苦工藝處理后，苦腸中膽汁酸含量顯著降低，口感上無明顯苦味，對營養(yǎng)成分的破壞性小，可以被消費者接受，彌補了苦腸脫苦方法的空白。試驗進(jìn)行了苦腸堿法脫苦的研究，未能探索在脫苦過程中苦腸加工物性的變化，后續(xù)研究將探討堿法處理對苦腸加工物性的影響。