侯敏娜 侯少平 吳滿芳 王 珊 彭修娟 劉 峰 閆歡歡

(1. 陜西國際商貿(mào)學(xué)院,陜西 咸陽 712046；2. 都昌縣第二人民醫(yī)院，江西 九江 332600；3. 陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075)

姜黃郁金又稱黃絲郁金，為姜黃屬植物姜黃(CurcumaLonga)的干燥塊根[1]，為常用中藥材,具有保肝利膽、降血脂、免疫抑制、抗癌、抗炎、抗氧化、中樞抑制等[2-3]藥理作用。郁金不僅可作為行氣舒肝解郁、降血脂等的藥膳品(如郁金茶、郁金木香茶、郁金清肝茶、荷葉郁金粥等)；還可以用于抗皺、美膚的化妝品領(lǐng)域；其色素已被廣泛用作食品和染料的添加劑[4]。郁金含有揮發(fā)油、多糖、黃酮、微量元素等[2,5]多種化學(xué)成分。目前，有關(guān)郁金的研究主要集中于治療肝病、抑郁癥、癲癇、哮喘等作用機(jī)制推測[6-10]，揮發(fā)油成分分析和含量測定方法[11-12]，以及不同品種郁金化學(xué)成分、藥理作用分析等[2]方面。而有關(guān)郁金多糖、黃酮共提工藝及其藥理活性的分析比較研究尚未見報道。

多糖和黃酮類成分在植物中普遍存在，具有抗氧化、防衰老、抗腫瘤等共性特點。其常用提取方法有溶劑提取法、超聲提取法、微波提取法等[13]。與其他方法相比，超聲提取法具有省時、省溶劑、易操作、廉價等優(yōu)勢[14]；響應(yīng)面試驗以較少的試驗次數(shù)、較短的提取時間對試驗參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，已被廣泛應(yīng)用于生物、化工及食品加工技術(shù)的模型建立及條件優(yōu)化[15]；滿意度函數(shù)是一種適合于多目標(biāo)優(yōu)化的方法，將不同響應(yīng)值轉(zhuǎn)化為0～1的無量綱數(shù)值，實現(xiàn)了多響應(yīng)值優(yōu)化轉(zhuǎn)變?yōu)閱雾憫?yīng)值優(yōu)化，易于尋求整體最優(yōu)[16]。

試驗擬采用超聲提取法，利用響應(yīng)面—滿意度函數(shù)法對姜黃郁金多糖和黃酮類成分共提條件進(jìn)行優(yōu)化；并以DPPH自由基、ABTS自由基清除率為指標(biāo)，分析姜黃郁金多糖和黃酮的抗氧化活性，旨在為姜黃郁金多糖和黃酮的深加工及藥材資源的廣泛、有效利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃郁金：經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室楊新杰教授鑒定為CurcumaLonga的根莖，陜西康宇制藥有限公司；

蘆丁對照品(批號為100080-201811)、葡萄糖對照品(批號為100082-201803)：中國藥品生物制品鑒定所；

DPPH、ABTS：上海源葉生物科技有限公司；

無水乙醇、硫酸、亞硝酸鈉、苯酚、硝酸鋁、過硫酸鉀、維生素C：分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速萬能粉碎機(jī)：FW-100型，北京科偉永興儀器有限公司；

電子分析天平：YP2102型，北京賽多利斯儀器有限公司；

數(shù)控超聲波提取器：KQ5200型，昆山市超聲儀器有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-111型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

紫外—可見分光光度計：TU-1810型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 預(yù)處理 將姜黃郁金于50 ℃干燥，粉碎，過5號篩，封存。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

(1) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取于105 ℃干燥后的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品5.032 mg，用純化水定容至50 mL，搖勻，得濃度為0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。參照硫酸—苯酚法[16-18]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=6.262 5x-0.012 8，R2=0.994 8。

(2) 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取于105 ℃干燥后的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.069 mg，用50%乙醇定容至25 mL，搖勻，得濃度為0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。參照文獻(xiàn)[19]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=1.891 0x+0.003 5，R2=0.997 4。

1.3.3 多糖和黃酮提取率測定 根據(jù)1.3.2方法進(jìn)行測定，按式(1)計算姜黃郁金多糖和黃酮提取率。

Y=[(C×V×N)/M]×100%，

(1)

式中：

Y——姜黃郁金多糖或黃酮提取率，%；

C——姜黃郁金多糖或黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——姜黃郁金多糖或黃酮體積，mL；

N——稀釋倍數(shù)；

M——藥材質(zhì)量，mg。

1.3.4 滿意度函數(shù) 以姜黃郁金多糖和黃酮提取率為響應(yīng)值，按式(2)轉(zhuǎn)化為無量綱的期望值di(0≤di≤1)，d越接近1，效果越好。將多個響應(yīng)值的wn次方根的積作為滿意度值D[16,19]，并按式(3)進(jìn)行計算。

(2)

(3)

式中：

Yi(x)——第i個指標(biāo)的響應(yīng)值；

Ymax,i、Ymin,i——最高、最低響應(yīng)值；

將姜黃郁金多糖提取率設(shè)為Y1，黃酮提取率設(shè)為Y2，經(jīng)查閱文獻(xiàn)[16,20]得知姜黃郁金多糖的最高提取率為1.151%，最小為0.000%；黃酮的最高提取率為0.314%，最小為0.000%。w1設(shè)為0.6，w2設(shè)為0.4，得滿意度D。利用響應(yīng)面軟件對滿意度進(jìn)行分析，滿意度對應(yīng)最大值的提取工藝即為最優(yōu)提取條件。

1.3.5 單因素試驗

(1) 乙醇體積分?jǐn)?shù)：在料液比(m姜黃郁金∶V水)1∶20 (g/mL)，超聲時間20 min，超聲溫度50 ℃下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(0%，20%，40%，60%)對姜黃郁金黃酮和多糖提取率的影響。

(2) 料液比：在提取溶劑為水，超聲時間20 min，超聲溫度50 ℃下，考察料液比[m姜黃郁金∶V水分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40 (g/mL)]對姜黃郁金黃酮和多糖提取率的影響。

(3) 超聲時間：在提取溶劑為水，料液比(m姜黃郁金∶V水)1∶20 (g/mL)，超聲溫度50 ℃下，考察超聲時間(15，20，25，30 min)對姜黃郁金黃酮和多糖提取率的影響。

(4) 超聲溫度：在提取溶劑為水，料液比(m姜黃郁金∶V水)1∶20 (g/mL)，超聲時間20 min下，考察超聲溫度(30，40，50，60 ℃)對姜黃郁金黃酮和多糖提取率的影響。

1.3.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以姜黃郁金黃酮和多糖提取率的滿意度為評價指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，優(yōu)選最佳提取工藝條件。

1.3.7 姜黃郁金多糖和黃酮抗氧化能力測定

(1) 對DPPH自由基的清除能力：參照文獻(xiàn)[21-23]并修改，分別配置濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL的姜黃郁金多糖和黃酮樣品溶液。移取2 mL不同濃度的兩種樣品溶液，各加入2 mL DPPH溶液，搖勻，暗處反應(yīng)30 min，測定517 nm處吸光度。以無水乙醇為空白對照，按式(4)計算自由基清除率。

(4)

式中：

K——自由基清除率，%；

Ai——樣品組吸光度；

Aj——樣品對照組吸光度；

A0——空白對照組吸光度。

(2) 對ABTS自由基的清除能力：參照文獻(xiàn)[23-24]并修改，測定734 nm處吸光度。以無水乙醇為空白對照，按式(4)計算自由基清除率。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2007軟件制作圖表，用Design Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

由圖1可知，當(dāng)提取溶劑為水時，姜黃郁金多糖和黃酮提取率均達(dá)最高，說明姜黃郁金多糖和黃酮極性偏大，在水中溶解度最好；當(dāng)料液比(m姜黃郁金∶V水)為1∶20 (g/mL)時，兩者提取率均達(dá)最高，隨著溶劑的增加，大部分水溶性雜質(zhì)浸出，阻止目標(biāo)成分溶出，提取率降低；當(dāng)超聲時間為20 min 時，姜黃郁金多糖提取率達(dá)最高，而黃酮提取率在15～20 min下降比較緩慢，超過20 min后下降較明顯，可能是由于隨著超聲時間的延長，超聲波的振蕩作用破壞了姜黃郁金中小分子多糖和黃酮類成分，使提取率降低；當(dāng)提取溫度為50 ℃時，姜黃郁金多糖和黃酮提取率均達(dá)最大，隨著超聲溫度的升高，小分子姜黃郁金黃酮和多糖成分發(fā)生分解或改變，提取率降低。故姜黃郁金多糖和黃酮共提條件為：以水為提取溶劑、料液比(m姜黃郁金∶V水)1∶20 (g/mL)、超聲時間20 min、超聲溫度50 ℃。

圖1 各因素對姜黃郁金多糖及黃酮共提得率的影響Figure 1 Effect of different factors on the co-extraction rate of polysaccharides and flavonoids from Curcuma Longa

2.2 姜黃郁金多糖和黃酮共提工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果 根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原則結(jié)合單因素試驗結(jié)果，以姜黃郁金多糖和黃酮提取率的滿意度為響應(yīng)值，選取料液比、超聲時間、超聲溫度為因素，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，因素水平見表1，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表1 試驗因素水平表Table 1 Experimental factor level table

2.2.2 回歸方程的建立與方差分析 對表2進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design of response surface experiment scheme

D=0.80+0.055A-0.066B+0.046C+9.675E-003AB-4.250E-003AC+0.048BC-0.28A2-0.089B2-0.11C2。

(5)

表3 方差分析?Table 3 Analysis of variance

2.2.3 響應(yīng)面分析 由圖2可知，姜黃郁金多糖和黃酮共提滿意度隨超聲時間和超聲溫度的延長呈先升高后下降趨勢，但變化緩慢，等高線圖略偏圓形，說明二者交互作用不顯著；料液比和超聲時間交互作用的曲面較陡，說明其對姜黃郁金多糖和黃酮共提滿意度影響較大，等高線圖近似橢圓形，說明兩因素與響應(yīng)值之間交互作用影響較大；料液比和超聲溫度交互作用的等高線圖呈橢圓形，說明二者與響應(yīng)值之間交互作用顯著。綜上，姜黃郁金多糖和黃酮共提條件范圍：超聲溫度45～55 ℃，料液比(m姜黃郁金∶V水) 1∶20～1∶25 (g/mL)，超聲時間15～25 min。

圖2 各因素交互作用對姜黃郁金多糖和黃酮共提滿意度的影響Figure 2 The satisfaction of Curcuma Longa polysaccharides and flavonoids co-extraction with different factors

2.3 工藝驗證

經(jīng)求導(dǎo)可得，姜黃郁金多糖及黃酮共提取的最佳工藝條件為：超聲溫度50 ℃，料液比(m姜黃郁金∶V水)1.0∶22.3 (g/mL)，超聲時間20 min，此時的預(yù)測滿意度為0.826 3，姜黃郁金多糖提取率為1.04%，黃酮提取率為0.25%。考慮實際的可操作性，將姜黃郁金多糖及黃酮共提條件調(diào)整為：超聲溫度50 ℃，料液比(m姜黃郁金∶V水)1∶22 (g/mL)，超聲時間20 min。通過3次平行實驗驗證，最佳工藝條件下的滿意度為0.823 7，與預(yù)測值相差極小，說明運用該試驗分析方法得出的提取工藝可靠、可行，此時多糖提取率為1.01%，黃酮提取率為0.23%。

2.4 姜黃郁金多糖和黃酮的抗氧化性

由圖3可知，姜黃郁金多糖和黃酮對DPPH自由基、ABTS自由基具有一定的清除能力，但兩者作用效果都明顯弱于維生素C，且黃酮對兩種自由基的清除能力強(qiáng)于多糖，這與黃酮類屬于多酚化合物，是天然抗氧劑有關(guān)。當(dāng)姜黃郁金粗多糖和黃酮質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除能力達(dá)最大，分別為(42.91±0.54)%，(65.46±0.38)%。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，其對ABTS自由基的清除能力達(dá)最大，為(33.28±0.69)%；當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時，其對ABTS自由基的清除能力達(dá)最大，為(34.26±0.18)%。

圖3 姜黃郁金多糖、黃酮及維生素C對自由基的清除能力Figure 3 The scavenging ability of Curcuma Longa polysaccharides, flavonoids and VC to different free radicals

3 結(jié)論

試驗表明，姜黃郁金多糖及黃酮共提條件為：以水為提取溶劑、超聲溫度50 ℃、料液比(m姜黃郁金∶V水)1∶22 (g/mL)、超聲時間20 min，此時姜黃郁金多糖、黃酮提取率分別為1.01%，0.23%，滿意度為0.823 7。在抗氧化作用的濃度范圍內(nèi)，當(dāng)姜黃郁金多糖和黃酮質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除能力均達(dá)最大，分別為(42.91±0.54)%，(65.46±0.38)%；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時，其對ABTS自由基的清除能力達(dá)最大，為(33.28±0.69)%；當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時，其對ABTS自由基的清除能力達(dá)最大，為(34.26±0.18)%，說明姜黃郁金多糖和黃酮具有較好的清除自由基能力，且黃酮的清除能力強(qiáng)于多糖。姜黃郁金多糖和黃酮成分組成較多且復(fù)雜，而抗氧化活性可能是其中一種或幾種成分發(fā)揮作用，其具體功能成分物質(zhì)有待于后續(xù)研究。