張曉婷 王滿生 邱浩楠 葉鳳凌 職士淇 陳 龍 何 強(qiáng) 王延周 董 怡

(1. 四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205；3. 農(nóng)業(yè)部麻類生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410205)

多酚是植物生長發(fā)育過程中重要的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物莖葉等組織中。研究[1-4]表明，多酚除具有抗氧化的生物活性作用外，還表現(xiàn)出良好的抑菌、抗炎、抗病毒、防癌抗癌、抑制腫瘤、防治心血管疾病等方面活性作用。

苧麻是一種多年生宿根性草本植物，一年可收獲多次，且葉片約占植株質(zhì)量的40%，是苧麻營養(yǎng)生長過程中生物產(chǎn)量最大的組織。苧麻葉富含琥珀酸、原兒茶酸等酚類物質(zhì)，具有較高的食品保健和藥用開發(fā)價(jià)值[5]。與傳統(tǒng)的白葉苧麻相比，青葉苧麻因葉背面無白色絨毛，極易被打碎和過篩，使其粉碎性能大大提高[6]。另外，青葉苧麻蛋白質(zhì)含量較高，且氨基酸含量在苧麻近緣植物中含量最為豐富[7]。因此，目前青葉苧麻主要用于調(diào)制加工成動(dòng)物飼料[8-11]，也有將葉片提取物嘗試用于藥物開發(fā)[12]，但在食品加工領(lǐng)域除了涉及葉片蛋白質(zhì)的提取[6, 13]外，有關(guān)葉片多酚類物質(zhì)及其活性的研究還未見報(bào)道。

目前多酚提取多采用水和甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑[14-15]，提取方法多為超聲輔助提取[16]、微波輔助提取[17]、超臨界流體提取[18-19]、加壓溶劑提取[20]和酶法輔助[21]等。有研究[22]表明，超聲波輔助提取過程會(huì)產(chǎn)生空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等，且多級(jí)效應(yīng)結(jié)合又產(chǎn)生高剪切力，產(chǎn)生微射流，加速細(xì)胞壁破碎速度，增加溶劑滲透作用，提高傳質(zhì)效率，縮短提取時(shí)間，能有效提高多酚提取率。因此，試驗(yàn)擬采用超聲輔助乙醇法提取青葉苧麻葉中的多酚物質(zhì)，優(yōu)化其提取工藝條件，并研究其抗氧化活性，以期為青葉苧麻葉多酚的深入研究和青葉苧麻資源的拓展利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青葉苧麻葉粉：過60目篩，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所；

無水碳酸鈉、無水乙醇、過硫酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；

沒食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：色譜純，上海源葉生物公司；

福林酚：分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；

水溶性維生素E(Trolox)、熒光素鈉、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)：色譜純，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；

2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：色譜純，上海麥克林生化科技有限公司；

電子天平：EAJ210-4A型，沈陽龍騰電子有限公司；

三頻數(shù)控超聲波清洗器：KQ-300VDE型，昆山市超聲儀器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-6000PC型，上海元析儀器有限公司；

電子恒溫水浴鍋：DWKW-4型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

多功能微孔板檢測儀：Synergy H1型，美國伯騰儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林酚法測定青葉苧麻葉提取液中總多酚含量。準(zhǔn)確稱取20.0 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0%)，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，制得200 mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱中避光保存。準(zhǔn)確吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.0，0.2，0.4，0.6，1.0，1.5 mL分別置于10 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容至刻度，得到?jīng)]食子酸工作液。于10 mL比色管中分別加入沒食子酸工作液1.0 mL，福林酚試劑0.5 mL，搖勻后加入15%的Na2CO3溶液1.5 mL，加水定容至刻度，搖勻后于40 ℃水浴靜置2 h，自來水冷卻后測定其在760 nm條件下的吸光度值。所得結(jié)果以吸光值為縱坐標(biāo)(Y)，沒食子酸質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制出沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，求得回歸方程為Y=0.010 1X+0.057 4，R2=0.994 4。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of gallic acid

1.2.2 青葉苧麻葉中多酚的提取 準(zhǔn)確稱取0.5 g苧麻樣品若干份(每3份為一組平行試驗(yàn))，按照一定的料液比添加一定量的一定濃度乙醇溶液，在一定條件下超聲提取，靜置冷卻后在25 ℃、6 000 r/min條件下離心30 min，取上清液備用。準(zhǔn)確吸取1.0 mL提取液(或根據(jù)實(shí)際需要按一定比例稀釋后再取用)，于10 mL比色管中，按1.2.1建立沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定提取液中總酚含量，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測液中總多酚濃度。

1.2.3 青葉苧麻葉多酚提取的單因素試驗(yàn)

(1) 料液比：固定提取溫度25 ℃、超聲功率300 W、超聲時(shí)間5 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，分別測定料液比(m苧麻∶V乙醇)為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL) 時(shí)的多酚提取量，確定合適的料液比。

(2) 乙醇體積分?jǐn)?shù)：根據(jù)優(yōu)化出的料液比，固定提取溫度25 ℃、超聲功率300 W、超聲時(shí)間5 min，分別測定乙醇體積分?jǐn)?shù)為0%，20%，40%，60%，100%時(shí)的多酚提取量，確定合適的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

(3) 提取溫度：根據(jù)優(yōu)化出的料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)，固定超聲功率300 W、超聲時(shí)間5 min，分別測定超聲溫度為25，35，40，45，55 ℃時(shí)的多酚提取量，確定合適的提取溫度。

(4) 超聲功率：根據(jù)優(yōu)化出的料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度，固定超聲時(shí)間為5 min，分別測定超聲功率為120，180，240，300 W時(shí)的多酚提取量，確定合適的超聲功率。

(5) 超聲時(shí)間：根據(jù)優(yōu)化出的料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和超聲功率，分別測定超聲時(shí)間為5，10，15，20 min 時(shí)的多酚提取量，確定合適的超聲時(shí)間。

1.2.4 多酚提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選出對(duì)其影響較大的因素，以多酚提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用Box-Benhnken進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件分析試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化青葉苧麻多酚超聲輔助提取工藝條件。

1.2.5 青葉苧麻葉多酚抗氧化活性評(píng)價(jià) 在最佳提取工藝條件下，提取青葉苧麻葉中的多酚，并分別從清除DPPH自由基能力、清除ABTS+自由基能力和氧自由基吸收能力(ORAC法)3個(gè)方面評(píng)價(jià)青葉苧麻葉中多酚的抗氧化活性。

(1) DPPH自由基清除能力：參照賀銀菊等[23]的方法，以IC50值對(duì)比青葉苧麻葉多酚提取溶液和沒食子酸清除DPPH自由基的能力。按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

QD——DPPH自由基清除能力，%；

A0——空白組吸光度值(0.5 mL樣品溶劑+0.5 mL的DPPH溶液)；

Ai——樣品組吸光度值(0.5 mL樣品溶液+0.5 mL的DPPH溶液)；

Aj——對(duì)照組吸光度值(0.5 mL樣品溶液+0.5 mL的DPPH乙醇溶液)。

(2) ABTS+自由基清除能力：參照蔡如玉等[24]的方法，以IC50值對(duì)比青葉苧麻葉多酚提取溶液和沒食子酸清除ABTS+自由基的能力。按式(2)計(jì)算ABTS+自由基清除率。

(2)

式中：

QA——ABTS+自由基清除能力，%；

A0——空白組吸光度值(50 μL樣品溶劑+950 μL ABTS+自由基稀釋溶液)；

Ai——樣品組吸光度值(50 μL樣品溶液+950 μL ABTS+自由基稀釋溶液)；

Aj——對(duì)照組吸光度值(50 μL樣品溶液+950 μL ABTS+自由基稀釋溶劑)。

(3) 氧自由基吸收能力(ORAC法)：參照余欣珂等[25]和董怡[26]的方法，以水溶性維生素E(Trolox)當(dāng)量值(g Trolox/g多酚)對(duì)比濃度為425.3 μg/L沒食子酸和總酚濃度為50 μg/L的青葉苧麻葉多酚提取液的氧自由基吸收能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

如圖2所示，優(yōu)化出的料液比(m苧麻∶V乙醇)為1∶

圖2 青葉苧麻葉多酚提取單因素試驗(yàn)結(jié)果Figure 2 Single factor experimental results of polyphenols extraction from leaves of green leaves ramie

40 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、提取溫度為40 ℃、超聲功率為180 W、超聲時(shí)間為5 min。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化青葉苧麻多酚提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面模型建立及分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，篩選出對(duì)多酚提取量影響較大的三因素分別為：料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度為優(yōu)化因素，因此后續(xù)將固定超聲功率和超聲時(shí)間分別為180 W和5 min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的編碼水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)水平因素Table 1 Response surface test level factors

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度與青葉苧麻多酚提取量(Y)的二次回歸模型為：

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Response surface analysis scheme and results

Y=47.74-0.018A+0.37B+0.66C-1.43AB-0.60AC+0.64BC-1.94A2-3.87B2-1.40C2。

(3)

表3 回歸方程方差分析?Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析 由圖3可知，3個(gè)響應(yīng)面的3D圖中部凸起，說明青葉苧麻多酚提取量(響應(yīng)值)存在最大值。超聲溫度的變化曲面較為陡峭，料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化曲面相較于溫度略顯平穩(wěn)，表明溫度對(duì)青葉苧麻多酚提取量的影響更為顯著，且等高線圖均為明顯的卵圓形，表明料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度之間有較為顯著的交互作用，對(duì)于青葉苧麻多酚提取量影響較大。

圖3 各因素交互作用對(duì)多酚提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖Figure 3 Response surface and contour map of the influence of interaction of various factors on polyphenol extraction amount

根據(jù)所建立的響應(yīng)面模型對(duì)青葉苧麻多酚提取量進(jìn)行工藝參數(shù)最優(yōu)化分析，得到青葉苧麻多酚提取最佳工藝參數(shù)條件為料液比(m苧麻∶V乙醇)1∶33 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)40.84%、提取溫度41.36 ℃，在此條件下青葉苧麻多酚提取量可以達(dá)到47.84 mg/g。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，選擇青葉苧麻多酚提取參數(shù)條件為料液比(m苧麻∶V乙醇)1∶33 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、提取溫度42 ℃，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示青葉苧麻葉多酚提取量為47.97 mg/g，與理論值非常接近，說明該模型預(yù)測可信。

2.3 多酚抗氧化活性評(píng)價(jià)

與以沒食子酸為對(duì)照，青葉苧麻葉多酚提取物清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力和氧自由基吸收能力(ORAC值)如表4所示。

2.3.1 DPPH自由基清除能力 沒食子酸和青葉苧麻葉中的多酚均具有一定的清除DPPH自由基的能力。由表4 可知，青葉苧麻多酚溶液清除DPPH自由基的IC50值小于沒食子酸溶液的，說明青葉苧麻多酚溶液對(duì)DPPH自由基的清除能力極顯著強(qiáng)于沒食子酸溶液(P<0.01)。

表4 青葉苧麻多酚抗氧化活性評(píng)價(jià)?Table 4 Evaluation of antioxidant activity of polyphenols from leaves of green leaves ramie

2.3.2 ABTS+自由基清除能力 沒食子酸和青葉苧麻葉中的多酚都具有一定的清除ABTS+自由基的能力。

由表4可知，青葉苧麻多酚溶液清除ABTS+自由基的IC50值小于沒食子酸溶液的，說明青葉苧麻多酚溶液對(duì)ABTS+自由基的清除能力極顯著強(qiáng)于沒食子酸溶液(P<0.01)。

2.3.3 氧自由基吸收能力(ORAC法) Trolox溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.615 9x+26.504(R2=0.999 4)。根據(jù)曲線方程，計(jì)算得到青葉苧麻葉多酚提取物與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照沒食子酸的氧自由基吸收能力。由表4可知，青葉苧麻多酚的氧自由基吸收能力明顯強(qiáng)于沒食子酸，且優(yōu)勢極顯著(P<0.01)。

圖4 Trolox溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Figuer 4 Standard curve of Trolox solution

多酚提取液中含有多種酚類物質(zhì)，各種酚類物質(zhì)通過拮抗、協(xié)同或疊加等效應(yīng)，影響提取液的生理活性[27-29]。這也可能是青葉苧麻葉多酚提取物表現(xiàn)出優(yōu)于沒食子酸的抗氧化性的原因。此外，多酚提取液生理活性還與其中多酚類物質(zhì)的含量顯著相關(guān)。

3 結(jié)論

在超聲波輔助提取青葉苧麻葉多酚中，料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率對(duì)多酚提取量都有不同程度的影響，其中料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間的影響較大。響應(yīng)面優(yōu)化后的提取條件為：料液比(m苧麻∶V乙醇)1∶33 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、提取溫度42 ℃，超聲功率180 W、超聲時(shí)間5 min，在此條件下青葉苧麻多酚提取量為47.97 mg/g。青葉苧麻葉多酚提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力，以及氧自由基吸收能力均強(qiáng)于沒食子酸。后期將針對(duì)其中多酚組成及各組分對(duì)其抗氧化性的貢獻(xiàn)作用進(jìn)行深入分析。