張 鳳 馬雅鴿 張 希 楊婧娟 趙聲蘭

(云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

分心木又稱核桃隔膜，為胡桃科植物胡桃(JuglansregiaL.)的木質(zhì)隔膜，富含黃酮類化合物，有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、降低血糖及抗心腦血管疾病等作用[1-3]。目前已有針對(duì)河北、新疆和甘肅等地的分心木黃酮提取及抗氧化活性的報(bào)道[4-6]，但未見有關(guān)分心木黃酮提取物體外降脂功效的研究報(bào)道。

中國核桃種植面積和產(chǎn)量世界第一，云南省又居全國之首，其種植面積2.87×106hm2，年產(chǎn)量超過8.50×105t，分心木占整個(gè)核桃的4%～5%，云南每年產(chǎn)生3.40×103～4.25×103t分心木[7-8]，目前大多分心木被丟棄或焚燒，僅有少量被開發(fā)為袋泡茶、速溶茶和保健功能酒[9-10]。試驗(yàn)擬采用生產(chǎn)成本低且適用于大批量工業(yè)生產(chǎn)的乙醇回流提取法提取分心木總黃酮，采用單因素結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，并研究分心木總黃酮的體外抗氧化活性及降低脂肪變性L02肝細(xì)胞TC和TG的活性，以期為分心木功能產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)，為延長(zhǎng)核桃產(chǎn)業(yè)鏈提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

分心木：南澗縣紅云核桃加工銷售有限責(zé)任公司；

蘆?。簩?duì)照品，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；

福林酚試劑、抗壞血酸(VC)：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

DPPH：美國Sigma公司；

人正常L-02肝細(xì)胞株：中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所；

胎牛血清：浙江天航生物科技有限公司；

非諾貝特：法國利博福尼制藥公司；

RPMI 1640培養(yǎng)液、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司;

20%醫(yī)用脂肪乳：四川科倫藥業(yè)股份有限公司；

醫(yī)用脂肪乳誘導(dǎo)液：20%醫(yī)用脂肪乳5 mL，用10%胎牛血清稀釋至50 mL。

1.1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)：UV-180型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

離心機(jī)：TD5A-WS型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；

酶標(biāo)儀：INFINITE M200 PRO型，瑞士TECAN公司；

CO2培養(yǎng)箱：MCO-20AIC型，日本三洋有限公司；

倒置顯微鏡：Nikoneclipse TS 100型，尼康儀器(上海)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分心木總黃酮提取工藝流程

分心木→粉碎→過篩(60目)→乙醇回流提取→過濾→離心(2 900 r/min，6 min)→分心木總黃酮提取液

1.2.2 總黃酮提取得率測(cè)定 根據(jù)梁杏等[11]的方法，以蘆丁溶液質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.010 3x+0.013 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6，表明蘆丁溶液質(zhì)量濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。按式(1)計(jì)算分心木總黃酮提取得率。

(1)

式中：

E——分心木總黃酮提取得率，%；

C——提取液黃酮的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——提取液體積，mL；

N——稀釋倍數(shù)；

M——分心木質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 預(yù)試驗(yàn)表明提取次數(shù)為2次的分心木總黃酮提取得率較提取1次和3次的高，故試驗(yàn)將提取次數(shù)固定為2次。

(1) 提取時(shí)間對(duì)分心木總黃酮提取得率的影響：分別稱取2.000 0 g分心木5份，于液固比(V乙醇∶m分心木)為40∶1 (mL/g)、乙醇濃度60%和60 ℃條件下，分別回流提取20，40，60，80，100 min，回流提取2次，計(jì)算總黃酮提取得率。

(2) 乙醇濃度對(duì)分心木總黃酮提取得率的影響：分別稱取2.000 0 g分心木8份，按液固比(V乙醇∶m分心木)為40∶1 (mL/g)，分別加入濃度為15%，25%，35%，45%，55%，65%，75%，85%乙醇，于60 ℃及上述確定的提取時(shí)間，回流提取2次，計(jì)算總黃酮提取得率。

(3) 液固比對(duì)分心木總黃酮提取得率的影響：分別稱取2.000 0 g分心木6份，于60 ℃及上述確定的提取時(shí)間和乙醇濃度，液固比(V乙醇∶m分心木)分別為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1 (mL/g)，回流提取2次，計(jì)算總黃酮提取得率。

(4) 提取溫度對(duì)分心木總黃酮提取得率的影響：分別稱取2.000 0 g分心木6份，按上述確定的提取時(shí)間、乙醇濃度和液固比，分別于40，50，60，70，80，90 ℃回流提取2次，計(jì)算總黃酮提取得率。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design Expert 8.0.6設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，以提取時(shí)間、乙醇濃度和提取溫度為因素，總黃酮提取得率為響應(yīng)值優(yōu)化提取條件。

(2)

式中：

K1——H2O2清除率，%；

A0——不加樣品的H2O2溶液吸光度值；

A1——加樣品的H2O2溶液吸光度值；

A2——不加H2O2溶液的樣品組吸光度值。

(3)

式中：

ΔA對(duì)照——1 min內(nèi)對(duì)照管吸光度的變化值；

ΔA樣品——1 min內(nèi)對(duì)照管吸光度的變化值。

(4)

式中：

K3——·OH清除率，%；

A0——試劑未損傷管吸光度值；

A1——試劑損傷管吸光度值；

A2——樣品未損傷管吸光度值；

A3——樣品損傷管吸光度值。

(5)

式中：

K4——DPPH清除率，%；

A1——4 mL DPPH溶液+4 mL樣品溶液的吸光度值；

A2——4 mL樣品提取液+4 mL乙醇的吸光度值；

A3——4 mL DPPH溶液+ 4 mL乙醇的吸光度值。

1.2.6 對(duì)脂變L02肝細(xì)胞總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的影響 采用醫(yī)用脂肪乳誘導(dǎo)正常L-02肝細(xì)胞構(gòu)建脂肪變性L-02肝細(xì)胞模型。按曹麗娟等[13]的方法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期L-02肝細(xì)胞，用G0液進(jìn)行饑餓處理24 h，造模組給予醫(yī)用脂肪乳誘導(dǎo)液培養(yǎng)48 h，對(duì)照組給予正常培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，得脂肪變性L-02肝細(xì)胞。將脂肪變性L-02肝細(xì)胞分為模型組、陽性藥組和給藥組，對(duì)照組和模型組給予G0液2 mL，陽性藥組給予非諾貝特2 mL，給藥組則分別給予2 mL 300 μg/mL和400 μg/mL分心木總黃酮。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，給藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2～3次，1.5 mL離心管收集刮取的細(xì)胞，按照試劑盒的說明書測(cè)定TC和TG含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 分心木總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn) 圖1(a)顯示，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮提取得率先升高后降低，80 min時(shí)總黃酮提取得率最高9.01%，在20～80 min時(shí)，分心木細(xì)胞壁逐漸被破壞，總黃酮物質(zhì)溶出逐漸增加，提取得率逐漸提高，之后再繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，其他非黃酮類物質(zhì)溶出，同時(shí)長(zhǎng)時(shí)間加熱破壞了溶出的黃酮，導(dǎo)致總黃酮提取得率下降[14]，故提取時(shí)間初步選擇80 min。圖1(b)顯示，隨著乙醇濃度的增大，總黃酮提取得率呈先升高后下降趨勢(shì)。適當(dāng)提高乙醇濃度，溶劑與總黃酮的極性靠近，總黃酮容易被提取出來，提取得率升高[15]，55%乙醇總黃酮提取得率最高7.093%，但乙醇濃度超過55%后，乙醇濃度增加，溶液沸點(diǎn)降低且高濃度乙醇和總黃酮的極性相差較大，不利于黃酮的提取，同時(shí)醇溶性雜質(zhì)溶出增加，導(dǎo)致總黃酮提取得率下降[16]，故乙醇濃度初定為55%。圖1(c)顯示，40～80 ℃，溫度升高總黃酮提取得率增加，80 ℃總黃酮提取得率達(dá)到最高值10.34%。溫度高于80 ℃后，總黃酮提取得率隨溫度的升高反而下降，溫度過高，乙醇揮發(fā)增加，使乙醇濃度降低及溫度過高雜質(zhì)溶出增加，導(dǎo)致總黃酮提取得率下降[17]，故初步確定提取溫度80 ℃。圖1(d) 顯示，隨液固比增加，總黃酮提取得率先升高后下降，在液固比(V乙醇∶m分心木)20∶1～40∶1 (mL/g)范圍，增加溶劑用量到液固比(V乙醇∶m分心木)40∶1 (mL/g)時(shí)，總黃酮提取得率最高9.92%，之后繼續(xù)增加溶劑反而會(huì)使其他醇溶性雜質(zhì)容易溶解，使總黃酮提取得率下降，且溶劑過多增加回收成本，故液固比(V乙醇∶m分心木)取40∶1 (mL/g)。

圖1 乙醇濃度、提取時(shí)間、溫度和液固比對(duì)分心木總黃酮提取得率的影響Figure 1 Effects of ethanol concentration,extraction time, temperature and liquid-solid ratio on the yield of flavone extraction

2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝 實(shí)際生產(chǎn)中液固比過高會(huì)消耗大量溶劑，增大后續(xù)濃縮及回收溶劑的操作難度，增加能耗及生產(chǎn)成本，故將液固比(V乙醇∶m分心木)固定為40∶1 (mL/g)。以提取時(shí)間、乙醇濃度和提取溫度為考察因素，總黃酮提取得率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels in the experiment

用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合和方差分析，得總黃酮提取得率回歸模型：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果Table 2 Response surface test and results

Q=9.76+0.041A+0.079B-0.22AB-0.14AC+0.10BC-0.70A2-0.75B2-1.34C。

(6)

表3 總黃酮提取得率的回歸方程方差分析表?Table 3 Analysis of variance for regression equation of flavonoid extraction yield

AB、AC和BC交互作用對(duì)分心木總黃酮提取得率影響的響應(yīng)面和等高線見圖2～4。圖2顯示，提取時(shí)間不變時(shí)，總黃酮提取得率隨乙醇濃度增加而增加，55%時(shí)出現(xiàn)極值后降低；乙醇濃度不變時(shí)，總黃酮提取得率隨提取時(shí)間增加先升高后降低。從圖2(b)可看出，等高線呈橢圓形，說明AB交互作用對(duì)分心木黃酮提取量的影響較大。圖3顯示，提取溫度比提取時(shí)間對(duì)分心木總黃酮提取得率的影響大，總黃酮提取得率隨溫度增加而增加，在80 ℃時(shí)出現(xiàn)極值后降低，等高線呈橢圓形，說明AC交互作用對(duì)黃酮提取量的影響較大，且圖3(b)的等高線沒有圖2(b)扁平，說明AB交互作用對(duì)黃酮提取量的影響大于AC。圖4顯示，分心木總黃酮提取得率隨乙醇濃度的增加先升高后降低，隨提取溫度的增加而升高。圖4(b)的等高線沒有圖3(b)扁平，說明BC的交互作用沒有AB、AC對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響大。

圖2 提取時(shí)間和乙醇濃度對(duì)總黃酮提取得率的交互影響Figure 2 Interactive effects of extraction time and ethanol concentration on flavone extraction yield

圖3 提取時(shí)間和提取溫度對(duì)總黃酮提取得率的交互影響Figure 3 Interactive effects of extraction time and temperature on flavonoid extraction yield

圖4 提取溫度和乙醇濃度對(duì)總黃酮提取得率的交互影響Figure 4 Interactive effects of extraction temperature and ethanol concentration on flavone extraction yield

用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析，得分心木總黃酮最優(yōu)提取條件為乙醇濃度55.25%，提取溫度80.70 ℃，回流提取時(shí)間80.46 min，總黃酮提取得率9.84%。結(jié)合實(shí)際，將最優(yōu)提取條件調(diào)整為乙醇濃度55%，提取溫度80 ℃，回流提取時(shí)間80 min。在此條件下，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總黃酮提取得率9.88%，與預(yù)測(cè)值較吻合，證明該響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果可靠。有文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道分心木中黃酮提取得率為5.17%～6.70%，低于試驗(yàn)分心木黃酮提取得率，可能是因?yàn)椴煌貐^(qū)分心木黃酮含量有所差別，或是因?yàn)椴煌崛l件對(duì)提取得率有影響。

2.2 分心木總黃酮體外抗氧化活性

圖5 分心木總黃酮對(duì)自由基的清除作用Figure 5 Free radical scavenging effect of distractive wood flavonoids

2.3 分心木總黃酮對(duì)脂變L02肝細(xì)胞TC和TG的影響

由表4可知，與正常組相比，模型組TC和TG含量顯著升高(P<0.001)，說明脂變L02肝細(xì)胞模型建立成功；與模型組相比，陽性藥非諾貝特組和分心木總黃酮300，400 μg/mL劑量組的TC和TG含量均顯著降低，且分心木總黃酮降低脂變L02肝細(xì)胞TC和TG呈劑量效應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，分心木總黃酮降低脂肪變性L02肝細(xì)胞TC和TG的活性高。

表4 分心木總黃酮對(duì)脂變L02肝細(xì)胞TC和TG的影響?Table 4 Effects of distracting flavonoids on TC and TG in Steatosis L02 liver cells

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化云南核桃分心木總黃酮提取最優(yōu)條件：乙醇濃度55%、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間80 min、液固比(V乙醇∶m分心木)40∶1 (mL/g)，此條件下分心木總黃酮提取得率為9.88%，高于文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道的(5.17%～6.70%)?？寡趸敖档蚑G、TC的研究發(fā)現(xiàn)，云南分心木總黃酮具有較高的抗氧化活性和降低脂肪變性L02肝細(xì)胞TC及TG的活性，說明分心木黃酮可開發(fā)作為食品、藥品、化妝品等行業(yè)的天然抗氧化劑，可開發(fā)為降脂藥物。試驗(yàn)未對(duì)分心木總黃酮物質(zhì)進(jìn)行純化分離，未進(jìn)行分心木總黃酮體內(nèi)降脂作用研究，后續(xù)可采用大孔吸附樹脂、硅膠及凝膠進(jìn)行分離純化，采用高脂模型大鼠或小鼠進(jìn)行分心木總黃酮的降脂作用研究，探究分心木黃酮抗氧化及降脂的量效關(guān)系、物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。