安 瑩 周 穎 季劍波 葛冬梅

(1. 徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221140；2. 徐州市食品藥品監(jiān)督管理局，江蘇 徐州 221140)

保健食品可分為功能性保健食品和營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑兩大類，降糖保健食品是功能性保健食品的一種。降糖保健食品只能作為糖尿病人輔助調(diào)理的手段，不能作為降糖的主要方法。由于雙胍類藥物的降血糖效果較好，常有商家將其添加在降糖保健食品中，但雙胍類物質(zhì)對(duì)正常人無(wú)降低血糖作用，還會(huì)在體內(nèi)蓄積，引起乳酸性酸中毒[1]。根據(jù)中國(guó)食品藥品管理法相關(guān)規(guī)定，保健食品不能代替藥物使用且不得添加任何形式的西藥成分。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局《降糖類中成藥中非法添加化學(xué)藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法》及《降糖類中成藥中非法添加鹽酸丁二胍補(bǔ)充檢驗(yàn)方法》等標(biāo)準(zhǔn)中給出了鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍及鹽酸丁二胍的檢測(cè)方法。目前常用的儀器檢測(cè)技術(shù)有分光光度法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、氣相色譜—質(zhì)譜法等[2]。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法對(duì)降血糖類保健食品中非法添加化學(xué)藥品的篩查和驗(yàn)證，共需用3個(gè)液相系統(tǒng)方法，耗時(shí)且繁瑣。

目前學(xué)者[3-5]普遍采用高效液相色譜法測(cè)定降糖類非法添加化學(xué)藥物，但是與質(zhì)譜法相比，高效液相色譜法的定性功能較差。近年來(lái)，液相色譜—串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)正逐漸成為非法添加化學(xué)藥品檢測(cè)的有效手段[6-7]。與上述方法相比，反相離子對(duì)—液質(zhì)聯(lián)用法具有分析時(shí)間短、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、分離度高、定性功能強(qiáng)等特點(diǎn)，可用于多組分降糖類非法添加化學(xué)藥物的同時(shí)檢測(cè)，避免復(fù)雜基質(zhì)干擾[8]。

研究擬以市售輔助降糖膠囊為研究對(duì)象，探索利用反向離子對(duì)—液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)定量檢測(cè)鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍及鹽酸丁二胍，根據(jù)藥效學(xué)特性，建立一次性同時(shí)篩選降糖類保健食品中可能違法添加的3種雙胍類化學(xué)藥品的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀(配DAD檢測(cè)器)：1200型，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀：4500型，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 試劑

鹽酸二甲雙胍(MH)標(biāo)準(zhǔn)品、鹽酸苯乙雙胍(PH)標(biāo)準(zhǔn)品、鹽酸丁二胍(BH)標(biāo)準(zhǔn)品：純度均大于99%，中國(guó)藥品生物制品檢定所；

甲醇、乙醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

甲醇：色譜純，德國(guó)Merk KGaA公司；

庚烷磺酸鈉、三乙胺、乙酸銨、醋酸銨：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 供試樣品

苦瓜洋參軟膠囊、黃芪紅景天鉻酵母軟膠囊、黃精山藥復(fù)合顆粒、葛根苦瓜鉻膠囊：益豐堂藥店。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 液相色譜條件 采用Agilent ZORBAX Eclipse XDS C18(4.6×250 mm，5 μm)液相色譜柱，二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇235 nm，掃描波長(zhǎng)范圍200～400 nm，柱溫設(shè)置30 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，稱取0.505 6 g庚烷磺酸鈉，加入1.4 mL三乙胺，加水定容至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5，制成2 mmol/L 的庚烷磺酸鈉離子對(duì)試劑，以甲醇(A)和離子對(duì)試劑(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。進(jìn)樣時(shí)間40 min。梯度洗脫程序?yàn)椋?～10 min，20% A；10～12 min，20%→40% A；12～30 min，40% A；30～31 min，40%→20% A；31～40 min，20% A。

1.4.2 液質(zhì)聯(lián)用條件

(1) 色譜條件：采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1×50 mm，18 μm)反相色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇235 nm，柱溫設(shè)置40 ℃，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，以甲醇(A)—0.01 mol/L乙酸銨溶液(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，分流比為5∶1。梯度洗脫程序?yàn)椋?～3 min，40% A；3～10 min，40%→60% A；10～30 min，60% A；30～40 min，60%→80% A；40～41 min，80% A；41～45 min，80%→40% A；45～60 min，40% A。

(2) 質(zhì)譜條件：電噴霧電離子源(ESI)，正離子掃描(ESI+)，毛細(xì)管電壓4.5 kV，干燥氣體溫度400 ℃，干燥氣流量10 L/min，一級(jí)質(zhì)譜全掃描、二級(jí)質(zhì)譜全掃描，掃描范圍m/z50～1 000。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制 分別精確稱取MH、PH、BH標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用甲醇稀釋后，配制成0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。臨用時(shí)，各取10 mL 混合制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 移取一定量的1.4.3所述混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，用甲醇加以稀釋，制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣10 μL，在1.4.1所述條件下分析，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，以色譜檢測(cè)峰面積為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得出各曲線的線性回歸方程。

1.4.5 供試樣的前處理 取膠囊4粒，去外囊殼后將內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于1次服用量)置于50 mL 錐形瓶中，分別以水、乙醇—水(V乙醇∶V水=1∶1)、乙醇、甲醇—水(V甲醇∶V水=1∶1)、甲醇為提取劑進(jìn)行提取，加入量25 mL，于50 ℃、功率400 W條件下超聲萃取30 min，冷至室溫，用提取劑稀釋至刻度，搖勻、用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾。根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)的提取率確定提取劑。

1.4.6 加標(biāo)回收試驗(yàn) 選取陰性供試樣品加標(biāo)回收開展試驗(yàn)，樣品分2組，加入2種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各做3個(gè)平行，按1.4.5方法進(jìn)行供試樣處理，在1.4.1所述液相條件下測(cè)定；分別計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑的選擇

分別考察水、乙醇—水(V乙醇∶V水=1∶1)、乙醇、甲醇—水(V甲醇∶V水=1∶1)、甲醇對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的提取率，結(jié)果(見圖1)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)以其他試劑為提取劑時(shí)，樣品中MH、PH、BH的提取率均不如以甲醇為提取劑的高，這是因?yàn)?種對(duì)照品屬于中高極性化合物，而甲醇的極性較大的緣故?；谙嗨葡嗳埽状紝?duì)目標(biāo)物質(zhì)的溶解性高于其他溶劑[9]。故試驗(yàn)選擇甲醇為提取劑。

圖1 不同提取劑的提取效果Figure 1 Extraction effects of different extractants

2.2 洗脫程序的選擇

雙胍類物質(zhì)極性大，分離時(shí)易受基質(zhì)干擾，可通過(guò)離子對(duì)試劑促進(jìn)樣品中目標(biāo)物質(zhì)離子化來(lái)改善峰形?？疾楦榛撬徕c和十二烷基硫酸鈉，因十二烷基磺酸鈉溶解時(shí)易產(chǎn)生泡沫影響檢測(cè)器穩(wěn)定性，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)誤差，故選用庚烷磺酸鈉配制離子對(duì)試劑。梯度洗脫色譜圖如圖2 所示，MH、BH、PH保留時(shí)間分別為0.76，1.59，3.19 min，可以同時(shí)分離MH、BH、PH，并得到較好的峰形。

圖2 梯度洗脫MH、PH、BH色譜圖Figure 2 Chromatogram of gradient elution of MH,PH and BH

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

基于目標(biāo)物質(zhì)特性，考查在正、負(fù)離子掃描模式下的質(zhì)譜響應(yīng)，如圖3所示，在正離子掃描模式下MH、PH、BH均可獲得良好的色譜峰形和較高的響應(yīng)值，故最終選擇在正離子模式下對(duì)3種目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行掃描分析。

圖3 混合對(duì)照品溶液的總離子流色譜圖Figure 3 Chromatogram of total ion flow of the mixed control solution

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，3種標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)>0.999 0，檢出限為0.018～0.077，相關(guān)參數(shù)見表1。如表2所示，該方法的加標(biāo)回收率為87.5%～108.4%，精密度(以峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD計(jì))為0.5%～7.4%，精密度、準(zhǔn)確度均良好。

表1 3種標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程及檢出限Table 1 Linear regression equations and detection limits of the three standards

表2 3種化學(xué)藥品在陰性供試樣中的加標(biāo)回收率

2.5 供試品溶液的定性測(cè)定

采用液質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行確認(rèn)。精密量取1.4.3標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液各5 μL，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，在1.4.2所述條件下分析，獲得標(biāo)準(zhǔn)品及供試品的色譜圖和質(zhì)譜圖(圖4～6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)譜峰不一致，由此可確定5個(gè)樣品中均不含有MH、BH及PH。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品BH和供試樣對(duì)照質(zhì)譜圖Figure 4 Mass spectrogram of reference standard BH and sample supplied

3 結(jié)論

建立了一種利用反相離子對(duì)—液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)快速篩查檢測(cè)降糖膠囊中3種雙胍類物質(zhì)的快速篩查和確證的方法，樣品提取方便快捷，可同時(shí)獲取一級(jí)、二級(jí)精確質(zhì)譜圖，以一級(jí)母離子進(jìn)行定量分析，可實(shí)現(xiàn)快速分析和測(cè)定。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品MH和供試樣對(duì)照質(zhì)譜圖Figure 5 Mass spectrogram of reference standard MH and sample supplied

圖6 標(biāo)準(zhǔn)品PH和供試樣對(duì)照質(zhì)譜圖Figure 6 Mass spectrogram of reference standard PH and sample supplied