安 瑩 周 穎 季劍波 葛冬梅

(1. 徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221140；2. 徐州市食品藥品監(jiān)督管理局，江蘇 徐州 221140)

保健食品可分為功能性保健食品和營養(yǎng)素補充劑兩大類，降糖保健食品是功能性保健食品的一種。降糖保健食品只能作為糖尿病人輔助調(diào)理的手段，不能作為降糖的主要方法。由于雙胍類藥物的降血糖效果較好，常有商家將其添加在降糖保健食品中，但雙胍類物質(zhì)對正常人無降低血糖作用，還會在體內(nèi)蓄積，引起乳酸性酸中毒[1]。根據(jù)中國食品藥品管理法相關(guān)規(guī)定，保健食品不能代替藥物使用且不得添加任何形式的西藥成分。國家食品藥品監(jiān)督管理局《降糖類中成藥中非法添加化學(xué)藥品補充檢驗方法》及《降糖類中成藥中非法添加鹽酸丁二胍補充檢驗方法》等標(biāo)準(zhǔn)中給出了鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍及鹽酸丁二胍的檢測方法。目前常用的儀器檢測技術(shù)有分光光度法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、氣相色譜—質(zhì)譜法等[2]。國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品檢驗補充檢驗方法對降血糖類保健食品中非法添加化學(xué)藥品的篩查和驗證，共需用3個液相系統(tǒng)方法，耗時且繁瑣。

目前學(xué)者[3-5]普遍采用高效液相色譜法測定降糖類非法添加化學(xué)藥物，但是與質(zhì)譜法相比，高效液相色譜法的定性功能較差。近年來，液相色譜—串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)正逐漸成為非法添加化學(xué)藥品檢測的有效手段[6-7]。與上述方法相比，反相離子對—液質(zhì)聯(lián)用法具有分析時間短、靈敏度高、專屬性強、分離度高、定性功能強等特點，可用于多組分降糖類非法添加化學(xué)藥物的同時檢測，避免復(fù)雜基質(zhì)干擾[8]。

研究擬以市售輔助降糖膠囊為研究對象，探索利用反向離子對—液質(zhì)聯(lián)用法同時定量檢測鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍及鹽酸丁二胍，根據(jù)藥效學(xué)特性，建立一次性同時篩選降糖類保健食品中可能違法添加的3種雙胍類化學(xué)藥品的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀(配DAD檢測器)：1200型，美國安捷倫科技有限公司；

三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀：4500型，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 試劑

鹽酸二甲雙胍(MH)標(biāo)準(zhǔn)品、鹽酸苯乙雙胍(PH)標(biāo)準(zhǔn)品、鹽酸丁二胍(BH)標(biāo)準(zhǔn)品：純度均大于99%，中國藥品生物制品檢定所；

甲醇、乙醇：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

甲醇：色譜純，德國Merk KGaA公司；

庚烷磺酸鈉、三乙胺、乙酸銨、醋酸銨：色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 供試樣品

苦瓜洋參軟膠囊、黃芪紅景天鉻酵母軟膠囊、黃精山藥復(fù)合顆粒、葛根苦瓜鉻膠囊：益豐堂藥店。

1.4 試驗方法

1.4.1 液相色譜條件 采用Agilent ZORBAX Eclipse XDS C18(4.6×250 mm，5 μm)液相色譜柱，二極管陣列檢測器，檢測波長選擇235 nm，掃描波長范圍200～400 nm，柱溫設(shè)置30 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，稱取0.505 6 g庚烷磺酸鈉，加入1.4 mL三乙胺，加水定容至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5，制成2 mmol/L 的庚烷磺酸鈉離子對試劑，以甲醇(A)和離子對試劑(B)為流動相進行梯度洗脫。進樣時間40 min。梯度洗脫程序為：0～10 min，20% A；10～12 min，20%→40% A；12～30 min，40% A；30～31 min，40%→20% A；31～40 min，20% A。

1.4.2 液質(zhì)聯(lián)用條件

(1) 色譜條件：采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1×50 mm，18 μm)反相色譜柱，檢測波長選擇235 nm，柱溫設(shè)置40 ℃，流速0.5 mL/min，進樣量5 μL，以甲醇(A)—0.01 mol/L乙酸銨溶液(B)為流動相進行梯度洗脫，分流比為5∶1。梯度洗脫程序為：0～3 min，40% A；3～10 min，40%→60% A；10～30 min，60% A；30～40 min，60%→80% A；40～41 min，80% A；41～45 min，80%→40% A；45～60 min，40% A。

(2) 質(zhì)譜條件：電噴霧電離子源(ESI)，正離子掃描(ESI+)，毛細(xì)管電壓4.5 kV，干燥氣體溫度400 ℃，干燥氣流量10 L/min，一級質(zhì)譜全掃描、二級質(zhì)譜全掃描，掃描范圍m/z50～1 000。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制 分別精確稱取MH、PH、BH標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用甲醇稀釋后，配制成0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩ＥR用時，各取10 mL 混合制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 移取一定量的1.4.3所述混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，用甲醇加以稀釋，制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進樣10 μL，在1.4.1所述條件下分析，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，以色譜檢測峰面積為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得出各曲線的線性回歸方程。

1.4.5 供試樣的前處理 取膠囊4粒，去外囊殼后將內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于1次服用量)置于50 mL 錐形瓶中，分別以水、乙醇—水(V乙醇∶V水=1∶1)、乙醇、甲醇—水(V甲醇∶V水=1∶1)、甲醇為提取劑進行提取，加入量25 mL，于50 ℃、功率400 W條件下超聲萃取30 min，冷至室溫，用提取劑稀釋至刻度，搖勻、用0.45 μm 微孔濾膜過濾。根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)的提取率確定提取劑。

1.4.6 加標(biāo)回收試驗 選取陰性供試樣品加標(biāo)回收開展試驗，樣品分2組，加入2種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各做3個平行，按1.4.5方法進行供試樣處理，在1.4.1所述液相條件下測定；分別計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑的選擇

分別考察水、乙醇—水(V乙醇∶V水=1∶1)、乙醇、甲醇—水(V甲醇∶V水=1∶1)、甲醇對目標(biāo)物質(zhì)的提取率，結(jié)果(見圖1)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)以其他試劑為提取劑時，樣品中MH、PH、BH的提取率均不如以甲醇為提取劑的高，這是因為3種對照品屬于中高極性化合物，而甲醇的極性較大的緣故?；谙嗨葡嗳埽状紝δ繕?biāo)物質(zhì)的溶解性高于其他溶劑[9]。故試驗選擇甲醇為提取劑。

圖1 不同提取劑的提取效果Figure 1 Extraction effects of different extractants

2.2 洗脫程序的選擇

雙胍類物質(zhì)極性大，分離時易受基質(zhì)干擾，可通過離子對試劑促進樣品中目標(biāo)物質(zhì)離子化來改善峰形?？疾楦榛撬徕c和十二烷基硫酸鈉，因十二烷基磺酸鈉溶解時易產(chǎn)生泡沫影響檢測器穩(wěn)定性，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)誤差，故選用庚烷磺酸鈉配制離子對試劑。梯度洗脫色譜圖如圖2 所示，MH、BH、PH保留時間分別為0.76，1.59，3.19 min，可以同時分離MH、BH、PH，并得到較好的峰形。

圖2 梯度洗脫MH、PH、BH色譜圖Figure 2 Chromatogram of gradient elution of MH,PH and BH

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

基于目標(biāo)物質(zhì)特性，考查在正、負(fù)離子掃描模式下的質(zhì)譜響應(yīng)，如圖3所示，在正離子掃描模式下MH、PH、BH均可獲得良好的色譜峰形和較高的響應(yīng)值，故最終選擇在正離子模式下對3種目標(biāo)物質(zhì)進行掃描分析。

圖3 混合對照品溶液的總離子流色譜圖Figure 3 Chromatogram of total ion flow of the mixed control solution

2.4 方法學(xué)驗證

經(jīng)方法學(xué)驗證，3種標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)>0.999 0，檢出限為0.018～0.077，相關(guān)參數(shù)見表1。如表2所示，該方法的加標(biāo)回收率為87.5%～108.4%，精密度(以峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD計)為0.5%～7.4%，精密度、準(zhǔn)確度均良好。

表1 3種標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程及檢出限Table 1 Linear regression equations and detection limits of the three standards

表2 3種化學(xué)藥品在陰性供試樣中的加標(biāo)回收率

2.5 供試品溶液的定性測定

采用液質(zhì)聯(lián)用法進行確認(rèn)。精密量取1.4.3標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液各5 μL，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，在1.4.2所述條件下分析，獲得標(biāo)準(zhǔn)品及供試品的色譜圖和質(zhì)譜圖(圖4～6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)譜峰不一致，由此可確定5個樣品中均不含有MH、BH及PH。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品BH和供試樣對照質(zhì)譜圖Figure 4 Mass spectrogram of reference standard BH and sample supplied

3 結(jié)論

建立了一種利用反相離子對—液質(zhì)聯(lián)用法同時快速篩查檢測降糖膠囊中3種雙胍類物質(zhì)的快速篩查和確證的方法，樣品提取方便快捷，可同時獲取一級、二級精確質(zhì)譜圖，以一級母離子進行定量分析，可實現(xiàn)快速分析和測定。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品MH和供試樣對照質(zhì)譜圖Figure 5 Mass spectrogram of reference standard MH and sample supplied

圖6 標(biāo)準(zhǔn)品PH和供試樣對照質(zhì)譜圖Figure 6 Mass spectrogram of reference standard PH and sample supplied