蔡潔云 王惠平 劉 巍 陳新瑞 許彥春 馬曉偉 李 超

(1. 云南省煙草質量監(jiān)督檢測站，云南 昆明 650104；2. 云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，云南 昆明 650024；3. 紅塔煙草〔集團〕有限責任公司，云南 玉溪 653100)

卷煙主流煙氣成分復雜，苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene，B[a]P)是卷煙主流煙氣中多環(huán)芳烴(PAHs)類物質[1]的典型代表性成分，是Hoffman名單的重要指標[2]。對痕量組分苯并[a]芘含量的準確檢測而言，干擾物繁多，難度較大，通常因前處理過程繁瑣復雜而導致檢測效率不高[3]。造成上述檢測困難的一個重要原因在于苯并[a]芘的同分異構體苯并[b]熒蒽(Benzo[b]fluoranthene，B[b]F)、苯并[k]熒蒽(Benzo[k]fluoranthene，B[k]F)、苯并[j]熒蒽(Benzo[j]fluoranthene，B[j]F)、苯并[j]醋蒽烯(Benz[j]aceanthrylene，B[j]A)、苯并[e]醋蒽烯(Benz[e]aceanthrylene，B[e]A)、苯并[e]芘(Benzo[e]pyrene，B[e]P)、苝(Perylene，PER)同樣普遍存在于卷煙主流煙氣中，同分異構體的存在影響了苯并[a]芘含量的準確測定。同分異構體中鏈接位置不同的碳鏈異構體的分離一直是個難點，對苯并[b]熒蒽和苯并[k]熒蒽的碳鏈異構體苯并[j]熒蒽的分離及測定，以及苯并[j]醋蒽烯、苯并[e]醋蒽烯、苯并[e]芘、苝的含量測定尚未見報道；對卷煙主流煙氣中苯并[a]芘及其同分異構體的同時測定研究也未見報道。

煙草及煙草制品中苯并[a]芘和多環(huán)芳烴含量的檢測方法主要有HPLC-FLD法[4-5]、LC-MS/MS法[6]、GC/MS法[7-8]及GC-MS/MS法[9-10]，幾乎所有方法均需采用固相萃取(SPE)或微固相萃取(MSPE)凈化樣品并對濾液進行濃縮后再進行色譜分析，處理過程繁瑣、耗時。樣品前處理中的固相萃取過程即便進行了充分的自動化優(yōu)化，也存在耗時長、試劑用量大等弊端[11-13]。試驗擬對儀器檢測分析方法進行優(yōu)選，采用GC-MS/MS法進行檢測，建立一種樣品前處理過程簡便、省時高效的方法測定卷煙主流煙氣中苯并[a]芘及其同分異構體含量，為卷煙危害性的準確評估及減害工作成效評估、卷煙質量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

3R4F和CM7參比卷煙：美國肯塔基大學；

JKA參比卷煙：國家煙草質量監(jiān)督檢驗中心；

商品卷煙樣品：8種不同牌號市售國產烤煙型卷煙樣品；

苯并[a]芘(B[a]P)、苯并[b]熒蒽(B[b]F)、苯并[k]熒蒽(B[k]F)、苯并[j]熒蒽(B[j]F)、苯并[e]芘(B[e]P)、苝(PER)、d12-苯并[a]芘標準品：純度≥98%，美國SUPELCO Solutions公司；

70%苯并[j]醋蒽烯(B[j]A)+ 30%苯并[e]醋蒽烯(B[e]A)標準品：加拿大TCR試劑公司；

環(huán)己烷：色譜純，美國Fisher Scientific公司。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平：G204型，瑞士梅特勒—托利多公司；

調速振蕩器：HY-8型，振蕩頻率≤160 r/min，設定值以不振碎濾片的最大速度為準，常州國華電器有限公司；

超聲波發(fā)生器：A Elmasonic P180H型，德國埃蘭漢斯施密博股份有限公司；

轉盤式全自動吸煙機：RM-200A型，德國伯格瓦特公司；

氣相色譜—三重串聯(lián)四極桿質譜聯(lián)用儀(GC-MS/MS)：7890A/7000B型，安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制 將苯并[a]芘、苯并[b]熒蒽(B[b]F)、苯并[k]熒蒽(B[k]F)、苯并[j]熒蒽(B[j]F)、苯并醋蒽烯(B[je]A)、苯并[e]芘(B[e]P)、苝(PER)標準物質用環(huán)己烷作溶劑，配置成1，2，5，10，20 ng/mL的系列標準溶液，其中內標d12-B[a]P濃度為8 ng/mL。

1.2.2 樣品處理 按GB/T 16450—2004收集20支卷煙主流煙氣的總粒相物，放入100 mL錐形瓶中，分別加入1 mL d12-B[a]P內標溶液(320.0 ng/mL)和40 mL環(huán)己烷，常溫振蕩萃取40 min，靜置5 min。將靜置后的萃取液通過0.22 μm的尼龍-66濾膜針頭過濾器，濾液裝入色譜瓶后直接進行GC-MS/MS分析，以內標法定量。

1.2.3 GC-MS/MS分析 進樣量1 μL；進樣方式為不分流進樣；色譜進樣口溫度260 ℃；色譜柱為DB-PAH毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司)；碰撞氣為氮氣，流速1.5 mL/min；載氣為氦氣，流速2.25 mL/min；程序升溫：初始溫度180 ℃，以6 ℃/min升至280 ℃，保持13.3 min；傳輸線溫度280 ℃；質譜電離方式：EI；離子源溫度280 ℃；質譜掃描方式：多反應監(jiān)測MRM模式；溶劑延遲5 min。

對目標物B[a]P及其同分異構體標準物質、內標物質d12-B[a]P的母離子、子離子以及碰撞能量(CE)等質譜檢測參數(shù)進行優(yōu)選。以最高濃度的工作溶液(20 ng/mL)為分析對象，通過全掃描模式選擇各目標物及內標物質合適的母離子；在此基礎上，5～60 eV下，以5 eV為檢測間隔，采用產物離子掃描模式進行檢測，優(yōu)選產物離子，優(yōu)化碰撞能量[14]。苯并[a]芘及其同分異構體和內標物質d12-B[a]P的相關參數(shù)如表1所示。

表1 苯并[a]芘及其同分異構體的MRM參數(shù)情況Table 1 MRM parameters of benzo[a] pyrene and its structural isomers

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 將標準系列溶液中待測物含量與內標量之比對色譜圖中待測物峰面積與內標面積的比值作圖，得工作曲線的a值和b值。按式(1)計算樣品中待測物含量。

(1)

式中：

ci——卷煙主流煙氣中苯并[a]芘及其同分異構體i的質量含量，ng/支；

Ai——萃取液中苯并[a]芘及其同分異構體i的峰面積；

a、b——由線性回歸方程求出；

ms——樣品溶液中的內標含量，ng；

As——內標峰面積；

V——萃取液體積，mL；

N——抽吸卷煙的數(shù)量，支。

1.2.5 萃取條件優(yōu)化 為選擇合適的萃取方式和萃取時間，按標準制備捕集20支卷煙主流煙氣總粒相物的劍橋濾片共10片，分別放入三角瓶中加入內標和環(huán)己烷，進行常溫超聲萃取和常溫振蕩萃取，萃取時間分別為20，30，40，50，60 min，考察不同萃取條件下苯并[a]芘及其同分異構體含量的變化。

1.2.6 檢出限、定量限測定 苯并[a]芘及其同分異構體

以標準溶液中最低濃度樣品(1 ng/mL)為代表，重復測定10次，所得測定值的標準偏差(SD)作為基準，以3SD計算方法的檢出限，以10SD計算方法的定量限。

1.2.7 重復性、重現(xiàn)性測定 對同一卷煙樣品按1.2.5方法進行樣品處理并進行含量測定，日內重復性以同一樣品每天重復測定5次，連續(xù)測定3 d，計算相對標準偏差來表示。日間重現(xiàn)性連續(xù)測定3 d，每天5 組樣品，計算相對標準偏差。

1.2.8 回收率測定 以3R4F參比卷煙樣品作為代表樣品，分成3份，按照低(1 ng/支)、中(5 ng/支)、高(10 ng/支) 3個濃度水平分別加入苯并[a]芘及其同分異構體標準品，每個添加水平重復測定5次。

2 結果與討論

2.1 萃取溶劑選擇

為選擇合適的萃取溶劑，經(jīng)調研發(fā)現(xiàn)：① 多環(huán)芳烴的溶液型市售商品中，多數(shù)標準品的溶劑為甲醇、二氯甲烷、環(huán)己烷、甲苯、乙腈、丙酮；② 市售的多環(huán)芳烴混合標準溶液有16種的溶劑為環(huán)己烷、有31種的溶劑為二氯甲烷。試驗表明，部分目標多環(huán)芳烴物質在甲醇、丙酮中微溶，且多數(shù)經(jīng)超聲處理5～10 min后仍不能完全溶解；同時，根據(jù)相似相溶原理，上述兩種溶劑與苯并[a]芘等多環(huán)芳烴的極性相差較大，因此排除。剩余的4種溶劑中，苯、二氯甲烷和甲苯均毒性較大，分別位于世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構公布的1類、2A類和3類致癌物清單中。故選擇環(huán)己烷作溶劑。

2.2 萃取條件優(yōu)化

由圖1可知，兩種萃取液中苯并[a]芘含量均隨萃取時間的延長逐漸增加。當萃取時間為20，30 min時，苯并[a]芘均未被完全萃?。划斴腿r間≥40 min時，苯并[a]芘萃取液中的含量均趨于穩(wěn)定。故萃取時間應≥40 min。超聲波發(fā)生器通常不具備冷卻功能，萃取過程中，槽內水溫會隨超聲時間的增長而升高。為滿足常溫下超聲萃取的條件，需更換槽內的水，較為繁雜。因此，考慮優(yōu)化萃取方式。

圖1 萃取條件對卷煙樣品檢測結果的影響Figure 1 Effects of shake conditions on the detection results of cigarettes

同一處理條件下，將3R4F參比卷煙樣品分別超聲萃取和振蕩萃取處理40 min后發(fā)現(xiàn)，兩種提取方式所得檢測結果無顯著差異(表2)，說明振蕩萃取可滿足樣品提取要求。

表2 超聲萃取和振蕩萃取所得3R4F中B[a]P含量Table 2 Results of B[a]P by ultrasonic extraction and oscillation extraction ng/支

由圖2可知，當萃取時間為20～30 min時，待測物并未完全溶解至萃取液中；當萃取時間≥40 min時，大部分待測物在萃取液中的含量趨于穩(wěn)定，少數(shù)呈現(xiàn)峰值。因此，較優(yōu)萃取時間為40 min。

圖2 萃取時間對卷煙樣品檢測結果的影響Figure 2 Effects of shake duration on the detection results of cigarettes

2.3 標準工作曲線與檢測限

由表3可知，苯并[a]芘及其同分異構體的線性范圍為1～20 ng/mL，線性相關系數(shù)為0.998 6～0.999 6，表明在測定濃度范圍內具有良好的線性關系。苯并[a]芘及其同分異構體的檢出限為0.028 3～0.090 8 ng/mL(等同于煙氣含量0.056 6～0.181 7 ng/支)，定量限為0.094 3～0.302 8 ng/mL(等同于煙氣含量0.188 6～0.605 5 ng/支)。

表3 苯并[a]芘及其同分異構體的標準工作曲線及方法的檢測限Table 3 Calibration curves, correlation coefficients, LOD and LOQ of benzo[a]pyrene and its structural isomers (n=10)

2.4 重復性與重現(xiàn)性

由表4可知，試驗方法測得的卷煙苯并[a]芘及其同分異構體日內重復性的相對標準偏差為1.91%～3.97%，日間重現(xiàn)性的相對標準偏差為2.54%～4.46%，均<5%，表明該方法重復性與穩(wěn)定性較好，能滿足定量要求。

1. 苯并[b]熒蒽 2. 苯并[k]熒蒽 3. 苯并[j]熒蒽 4. 苯并[j]醋蒽烯+苯并[e]醋蒽烯 5. 苯并[e]芘 6. 苯并[a]芘 7. 苝

表4 苯并[a]芘及其同分異構體的日內重復性和日間重現(xiàn)性Table 4 Intraday repeatability and daytime reproducibility of detection of benzo[a]pyrene and its structural isomers (n=15)

2.5 回收率

由表5可知，苯并[a]芘及其同分異構體的加標回收率為92.60%～107.60%，相對標準偏差為0.40%～3.01%，表明該方法能滿足定量要求。

表5 苯并[a]芘及其同分異構體的加標回收率和精密度Table 5 Recoveries and precisions of detection of benzo[a]pyrene and its structural isomers (n=5)

2.6 對比試驗

由表6可知，不同文獻所列苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽和苯并[a]芘含量的檢測值與試驗方法的一致性較好，說明試驗方法準確性較好。

表6 3R4F參比卷煙中7種PAHs的檢測結果Table 6 Results of benzo[a]pyrene and its structural isomers of reference cigarette 3R4F ng/支

2.7 卷煙樣品的分析測定

采用試驗方法對CM7參比卷煙和8種不同牌號市售國產烤煙型卷煙樣品進行分析。

2.7.1 CM7參比卷煙 由圖3可知， 卷煙主流煙氣中苯并[a]芘及其同分異構體相互分離較好，苯并[a]芘與其碳鏈異構體苯并[e]芘分離度較好。

2.7.2 商品卷煙 由表7可知，商品卷煙的相對平均偏差均在5%以內。綜上，試驗方法可作為一種卷煙主流煙氣中苯并[a]芘及其同分異構體含量快速檢測的新方法。

表7 商品卷煙的苯并[a]芘及其同分異構體含量Table 7 Results of benzo[a]pyrene and its structural isomers of cigarettes determined by this method (n=2) ng/支

3 結論

試驗建立了一種基于氣相色譜—串聯(lián)質譜技術測定卷煙主流煙氣中苯并[a]芘及其同分異構體苯并[b]熒蒽(B[b]F)、苯并[k]熒蒽(B[k]F)、苯并[j]熒蒽(B[j]F)、苯并[j]醋蒽烯(B[j]A)、苯并[e]醋蒽烯(B[e]A)、苯并[e]芘(B[e]P)、苝(PER)含量的方法。經(jīng)驗證，試驗方法與現(xiàn)行標準方法間無顯著性差異，可靠性有保障；操作簡便，重復性好，受固相萃取柱等耗材穩(wěn)定性和人為因素影響較小，可作為一種卷煙主流煙氣中苯并[a]芘及其同分異構體含量的快速檢測方法加以推廣。同分異構體中鏈接位置不同的碳鏈異構體的分離一直是個難點，試驗尚未解決苯并[j]醋蒽烯與苯并[e]醋蒽烯碳鏈異構體的分離，此問題的關鍵點可能在于獲得苯并[j]醋蒽烯與苯并[e]醋蒽烯單體化合物標準品，在此基礎上，優(yōu)選色譜柱及參數(shù)進行分離檢測。