蔡潔云 王惠平 劉 巍 陳新瑞 許彥春 馬曉偉 李 超

(1. 云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站，云南 昆明 650104；2. 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650024；3. 紅塔煙草〔集團(tuán)〕有限責(zé)任公司，云南 玉溪 653100)

卷煙主流煙氣成分復(fù)雜，苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene，B[a]P)是卷煙主流煙氣中多環(huán)芳烴(PAHs)類(lèi)物質(zhì)[1]的典型代表性成分，是Hoffman名單的重要指標(biāo)[2]。對(duì)痕量組分苯并[a]芘含量的準(zhǔn)確檢測(cè)而言，干擾物繁多，難度較大，通常因前處理過(guò)程繁瑣復(fù)雜而導(dǎo)致檢測(cè)效率不高[3]。造成上述檢測(cè)困難的一個(gè)重要原因在于苯并[a]芘的同分異構(gòu)體苯并[b]熒蒽(Benzo[b]fluoranthene，B[b]F)、苯并[k]熒蒽(Benzo[k]fluoranthene，B[k]F)、苯并[j]熒蒽(Benzo[j]fluoranthene，B[j]F)、苯并[j]醋蒽烯(Benz[j]aceanthrylene，B[j]A)、苯并[e]醋蒽烯(Benz[e]aceanthrylene，B[e]A)、苯并[e]芘(Benzo[e]pyrene，B[e]P)、苝(Perylene，PER)同樣普遍存在于卷煙主流煙氣中，同分異構(gòu)體的存在影響了苯并[a]芘含量的準(zhǔn)確測(cè)定。同分異構(gòu)體中鏈接位置不同的碳鏈異構(gòu)體的分離一直是個(gè)難點(diǎn)，對(duì)苯并[b]熒蒽和苯并[k]熒蒽的碳鏈異構(gòu)體苯并[j]熒蒽的分離及測(cè)定，以及苯并[j]醋蒽烯、苯并[e]醋蒽烯、苯并[e]芘、苝的含量測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道；對(duì)卷煙主流煙氣中苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體的同時(shí)測(cè)定研究也未見(jiàn)報(bào)道。

煙草及煙草制品中苯并[a]芘和多環(huán)芳烴含量的檢測(cè)方法主要有HPLC-FLD法[4-5]、LC-MS/MS法[6]、GC/MS法[7-8]及GC-MS/MS法[9-10]，幾乎所有方法均需采用固相萃取(SPE)或微固相萃取(MSPE)凈化樣品并對(duì)濾液進(jìn)行濃縮后再進(jìn)行色譜分析，處理過(guò)程繁瑣、耗時(shí)。樣品前處理中的固相萃取過(guò)程即便進(jìn)行了充分的自動(dòng)化優(yōu)化，也存在耗時(shí)長(zhǎng)、試劑用量大等弊端[11-13]。試驗(yàn)擬對(duì)儀器檢測(cè)分析方法進(jìn)行優(yōu)選，采用GC-MS/MS法進(jìn)行檢測(cè)，建立一種樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)便、省時(shí)高效的方法測(cè)定卷煙主流煙氣中苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體含量，為卷煙危害性的準(zhǔn)確評(píng)估及減害工作成效評(píng)估、卷煙質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

3R4F和CM7參比卷煙：美國(guó)肯塔基大學(xué)；

JKA參比卷煙：國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心；

商品卷煙樣品：8種不同牌號(hào)市售國(guó)產(chǎn)烤煙型卷煙樣品；

苯并[a]芘(B[a]P)、苯并[b]熒蒽(B[b]F)、苯并[k]熒蒽(B[k]F)、苯并[j]熒蒽(B[j]F)、苯并[e]芘(B[e]P)、苝(PER)、d12-苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，美國(guó)SUPELCO Solutions公司；

70%苯并[j]醋蒽烯(B[j]A)+ 30%苯并[e]醋蒽烯(B[e]A)標(biāo)準(zhǔn)品：加拿大TCR試劑公司；

環(huán)己烷：色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：G204型，瑞士梅特勒—托利多公司；

調(diào)速振蕩器：HY-8型，振蕩頻率≤160 r/min，設(shè)定值以不振碎濾片的最大速度為準(zhǔn)，常州國(guó)華電器有限公司；

超聲波發(fā)生器：A Elmasonic P180H型，德國(guó)埃蘭漢斯施密博股份有限公司；

轉(zhuǎn)盤(pán)式全自動(dòng)吸煙機(jī)：RM-200A型，德國(guó)伯格瓦特公司；

氣相色譜—三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS/MS)：7890A/7000B型，安捷倫科技(中國(guó))有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 將苯并[a]芘、苯并[b]熒蒽(B[b]F)、苯并[k]熒蒽(B[k]F)、苯并[j]熒蒽(B[j]F)、苯并醋蒽烯(B[je]A)、苯并[e]芘(B[e]P)、苝(PER)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用環(huán)己烷作溶劑，配置成1，2，5，10，20 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中內(nèi)標(biāo)d12-B[a]P濃度為8 ng/mL。

1.2.2 樣品處理 按GB/T 16450—2004收集20支卷煙主流煙氣的總粒相物，放入100 mL錐形瓶中，分別加入1 mL d12-B[a]P內(nèi)標(biāo)溶液(320.0 ng/mL)和40 mL環(huán)己烷，常溫振蕩萃取40 min，靜置5 min。將靜置后的萃取液通過(guò)0.22 μm的尼龍-66濾膜針頭過(guò)濾器，濾液裝入色譜瓶后直接進(jìn)行GC-MS/MS分析，以?xún)?nèi)標(biāo)法定量。

1.2.3 GC-MS/MS分析 進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣；色譜進(jìn)樣口溫度260 ℃；色譜柱為DB-PAH毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國(guó)Agilent公司)；碰撞氣為氮?dú)?，流?.5 mL/min；載氣為氦氣，流速2.25 mL/min；程序升溫：初始溫度180 ℃，以6 ℃/min升至280 ℃，保持13.3 min；傳輸線溫度280 ℃；質(zhì)譜電離方式：EI；離子源溫度280 ℃；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM模式；溶劑延遲5 min。

對(duì)目標(biāo)物B[a]P及其同分異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)d12-B[a]P的母離子、子離子以及碰撞能量(CE)等質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)選。以最高濃度的工作溶液(20 ng/mL)為分析對(duì)象，通過(guò)全掃描模式選擇各目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)合適的母離子；在此基礎(chǔ)上，5～60 eV下，以5 eV為檢測(cè)間隔，采用產(chǎn)物離子掃描模式進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)選產(chǎn)物離子，優(yōu)化碰撞能量[14]。苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)d12-B[a]P的相關(guān)參數(shù)如表1所示。

表1 苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體的MRM參數(shù)情況Table 1 MRM parameters of benzo[a] pyrene and its structural isomers

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中待測(cè)物含量與內(nèi)標(biāo)量之比對(duì)色譜圖中待測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)面積的比值作圖，得工作曲線的a值和b值。按式(1)計(jì)算樣品中待測(cè)物含量。

(1)

式中：

ci——卷煙主流煙氣中苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體i的質(zhì)量含量，ng/支；

Ai——萃取液中苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體i的峰面積；

a、b——由線性回歸方程求出；

ms——樣品溶液中的內(nèi)標(biāo)含量，ng；

As——內(nèi)標(biāo)峰面積；

V——萃取液體積，mL；

N——抽吸卷煙的數(shù)量，支。

1.2.5 萃取條件優(yōu)化 為選擇合適的萃取方式和萃取時(shí)間，按標(biāo)準(zhǔn)制備捕集20支卷煙主流煙氣總粒相物的劍橋?yàn)V片共10片，分別放入三角瓶中加入內(nèi)標(biāo)和環(huán)己烷，進(jìn)行常溫超聲萃取和常溫振蕩萃取，萃取時(shí)間分別為20，30，40，50，60 min，考察不同萃取條件下苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體含量的變化。

1.2.6 檢出限、定量限測(cè)定 苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體

以標(biāo)準(zhǔn)溶液中最低濃度樣品(1 ng/mL)為代表，重復(fù)測(cè)定10次，所得測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)作為基準(zhǔn)，以3SD計(jì)算方法的檢出限，以10SD計(jì)算方法的定量限。

1.2.7 重復(fù)性、重現(xiàn)性測(cè)定 對(duì)同一卷煙樣品按1.2.5方法進(jìn)行樣品處理并進(jìn)行含量測(cè)定，日內(nèi)重復(fù)性以同一樣品每天重復(fù)測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。日間重現(xiàn)性連續(xù)測(cè)定3 d，每天5 組樣品，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.8 回收率測(cè)定 以3R4F參比卷煙樣品作為代表樣品，分成3份，按照低(1 ng/支)、中(5 ng/支)、高(10 ng/支) 3個(gè)濃度水平分別加入苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定5次。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取溶劑選擇

為選擇合適的萃取溶劑，經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)：① 多環(huán)芳烴的溶液型市售商品中，多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品的溶劑為甲醇、二氯甲烷、環(huán)己烷、甲苯、乙腈、丙酮；② 市售的多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液有16種的溶劑為環(huán)己烷、有31種的溶劑為二氯甲烷。試驗(yàn)表明，部分目標(biāo)多環(huán)芳烴物質(zhì)在甲醇、丙酮中微溶，且多數(shù)經(jīng)超聲處理5～10 min后仍不能完全溶解；同時(shí)，根據(jù)相似相溶原理，上述兩種溶劑與苯并[a]芘等多環(huán)芳烴的極性相差較大，因此排除。剩余的4種溶劑中，苯、二氯甲烷和甲苯均毒性較大，分別位于世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的1類(lèi)、2A類(lèi)和3類(lèi)致癌物清單中。故選擇環(huán)己烷作溶劑。

2.2 萃取條件優(yōu)化

由圖1可知，兩種萃取液中苯并[a]芘含量均隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。當(dāng)萃取時(shí)間為20，30 min時(shí)，苯并[a]芘均未被完全萃??；當(dāng)萃取時(shí)間≥40 min時(shí)，苯并[a]芘萃取液中的含量均趨于穩(wěn)定。故萃取時(shí)間應(yīng)≥40 min。超聲波發(fā)生器通常不具備冷卻功能，萃取過(guò)程中，槽內(nèi)水溫會(huì)隨超聲時(shí)間的增長(zhǎng)而升高。為滿(mǎn)足常溫下超聲萃取的條件，需更換槽內(nèi)的水，較為繁雜。因此，考慮優(yōu)化萃取方式。

圖1 萃取條件對(duì)卷煙樣品檢測(cè)結(jié)果的影響Figure 1 Effects of shake conditions on the detection results of cigarettes

同一處理?xiàng)l件下，將3R4F參比卷煙樣品分別超聲萃取和振蕩萃取處理40 min后發(fā)現(xiàn)，兩種提取方式所得檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異(表2)，說(shuō)明振蕩萃取可滿(mǎn)足樣品提取要求。

表2 超聲萃取和振蕩萃取所得3R4F中B[a]P含量Table 2 Results of B[a]P by ultrasonic extraction and oscillation extraction ng/支

由圖2可知，當(dāng)萃取時(shí)間為20～30 min時(shí)，待測(cè)物并未完全溶解至萃取液中；當(dāng)萃取時(shí)間≥40 min時(shí)，大部分待測(cè)物在萃取液中的含量趨于穩(wěn)定，少數(shù)呈現(xiàn)峰值。因此，較優(yōu)萃取時(shí)間為40 min。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)卷煙樣品檢測(cè)結(jié)果的影響Figure 2 Effects of shake duration on the detection results of cigarettes

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與檢測(cè)限

由表3可知，苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體的線性范圍為1～20 ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)為0.998 6～0.999 6，表明在測(cè)定濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體的檢出限為0.028 3～0.090 8 ng/mL(等同于煙氣含量0.056 6～0.181 7 ng/支)，定量限為0.094 3～0.302 8 ng/mL(等同于煙氣含量0.188 6～0.605 5 ng/支)。

表3 苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及方法的檢測(cè)限Table 3 Calibration curves, correlation coefficients, LOD and LOQ of benzo[a]pyrene and its structural isomers (n=10)

2.4 重復(fù)性與重現(xiàn)性

由表4可知，試驗(yàn)方法測(cè)得的卷煙苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體日內(nèi)重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.91%～3.97%，日間重現(xiàn)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.54%～4.46%，均<5%，表明該方法重復(fù)性與穩(wěn)定性較好，能滿(mǎn)足定量要求。

1. 苯并[b]熒蒽 2. 苯并[k]熒蒽 3. 苯并[j]熒蒽 4. 苯并[j]醋蒽烯+苯并[e]醋蒽烯 5. 苯并[e]芘 6. 苯并[a]芘 7. 苝

表4 苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體的日內(nèi)重復(fù)性和日間重現(xiàn)性Table 4 Intraday repeatability and daytime reproducibility of detection of benzo[a]pyrene and its structural isomers (n=15)

2.5 回收率

由表5可知，苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體的加標(biāo)回收率為92.60%～107.60%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.40%～3.01%，表明該方法能滿(mǎn)足定量要求。

表5 苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體的加標(biāo)回收率和精密度Table 5 Recoveries and precisions of detection of benzo[a]pyrene and its structural isomers (n=5)

2.6 對(duì)比試驗(yàn)

由表6可知，不同文獻(xiàn)所列苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽和苯并[a]芘含量的檢測(cè)值與試驗(yàn)方法的一致性較好，說(shuō)明試驗(yàn)方法準(zhǔn)確性較好。

表6 3R4F參比卷煙中7種PAHs的檢測(cè)結(jié)果Table 6 Results of benzo[a]pyrene and its structural isomers of reference cigarette 3R4F ng/支

2.7 卷煙樣品的分析測(cè)定

采用試驗(yàn)方法對(duì)CM7參比卷煙和8種不同牌號(hào)市售國(guó)產(chǎn)烤煙型卷煙樣品進(jìn)行分析。

2.7.1 CM7參比卷煙 由圖3可知， 卷煙主流煙氣中苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體相互分離較好，苯并[a]芘與其碳鏈異構(gòu)體苯并[e]芘分離度較好。

2.7.2 商品卷煙 由表7可知，商品卷煙的相對(duì)平均偏差均在5%以?xún)?nèi)。綜上，試驗(yàn)方法可作為一種卷煙主流煙氣中苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體含量快速檢測(cè)的新方法。

表7 商品卷煙的苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體含量Table 7 Results of benzo[a]pyrene and its structural isomers of cigarettes determined by this method (n=2) ng/支

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了一種基于氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定卷煙主流煙氣中苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體苯并[b]熒蒽(B[b]F)、苯并[k]熒蒽(B[k]F)、苯并[j]熒蒽(B[j]F)、苯并[j]醋蒽烯(B[j]A)、苯并[e]醋蒽烯(B[e]A)、苯并[e]芘(B[e]P)、苝(PER)含量的方法。經(jīng)驗(yàn)證，試驗(yàn)方法與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法間無(wú)顯著性差異，可靠性有保障；操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，受固相萃取柱等耗材穩(wěn)定性和人為因素影響較小，可作為一種卷煙主流煙氣中苯并[a]芘及其同分異構(gòu)體含量的快速檢測(cè)方法加以推廣。同分異構(gòu)體中鏈接位置不同的碳鏈異構(gòu)體的分離一直是個(gè)難點(diǎn)，試驗(yàn)尚未解決苯并[j]醋蒽烯與苯并[e]醋蒽烯碳鏈異構(gòu)體的分離，此問(wèn)題的關(guān)鍵點(diǎn)可能在于獲得苯并[j]醋蒽烯與苯并[e]醋蒽烯單體化合物標(biāo)準(zhǔn)品，在此基礎(chǔ)上，優(yōu)選色譜柱及參數(shù)進(jìn)行分離檢測(cè)。