楊宇哲 李桐云 李 武 楊瑞麗

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642; 2. 海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS) 是心腦血管疾病的重要病程之一，慢性炎癥及膽固醇代謝異常是動(dòng)脈粥樣硬化最危險(xiǎn)的因素[1-2]。巨噬細(xì)胞是一類具有高度異質(zhì)性的細(xì)胞群，在促炎的微環(huán)境下，巨噬細(xì)胞極化成M1型，顯著上調(diào)腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β和IL-6等細(xì)胞因子的基因表達(dá)和分泌量，促進(jìn)炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[3-5]。此外，巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中的關(guān)鍵性步驟[6]，而這主要與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝異常密切相關(guān)。研究[7]發(fā)現(xiàn)，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL) 等膽固醇經(jīng)白細(xì)胞分化抗原36(CD36)攝取，在巨噬細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變成膽固醇酯并大量蓄積，巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1(ABCG1)等膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇流出[8-9]，維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡，進(jìn)而抑制泡沫細(xì)胞形成。抑制M1型巨噬細(xì)胞的大量聚集和泡沫細(xì)胞的形成，對(duì)于預(yù)防AS的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。

多酚類物質(zhì)具有抗氧化、降血脂、改善心腦血管疾病等活性[10-11]，但是多酚的生物利用率極低，超過95%的膳食多酚不能被小腸吸收[12-13]，而通過結(jié)腸微生物代謝轉(zhuǎn)化成其他小分子物質(zhì)再吸收進(jìn)入人體發(fā)揮生物活性作用，例如鞣花酸和鞣花單寧被腸道菌群轉(zhuǎn)化生成的尿石素類物質(zhì)[14]，大豆異黃酮被腸道菌群轉(zhuǎn)化生成雌馬酚[15]。已有研究證明，4-羥基苯乙酸(4-hydroxyphenylacetic acid，4-HPAA)是原花青素、山奈酚等多酚類物質(zhì)的主要腸道菌群代謝物[16-18]，且4-HPAA能提高小鼠抗氧化酶和肝臟Ⅱ相代謝酶活力進(jìn)而預(yù)防肝損傷[19]。目前，尚未見4-HPAA對(duì)M1型巨噬細(xì)胞極化以及對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫樣化的研究報(bào)道。試驗(yàn)擬探究4-HPPA對(duì)M1型巨噬細(xì)胞極化過程的作用，并初步研究其對(duì)巨噬—泡沫細(xì)胞形成的影響，從而探討多酚腸道菌群代謝物4-HHPA抗動(dòng)脈硬化的作用，以期為多酚預(yù)防和改善動(dòng)脈粥樣硬化作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系：廣州中醫(yī)藥大學(xué)；

4-羥基苯乙酸、脂多糖、干擾素：美國(guó)Sigma公司；

氧化低密度脂蛋白：廣州弈元生物技術(shù)有限公司；

油紅O：美國(guó)Gibico公司；

TNF-α、IL-6 和IL-1βELISA試劑盒：美國(guó)R&D System公司；

總膽固醇、游離膽固醇試劑盒：北京普利萊生物技術(shù)有限公司；

DMEM培養(yǎng)基：美國(guó)Gibico公司；

細(xì)胞總RNA提取試劑盒、Synthesis Super Mix for q PCR、Trans Start Tip Green q PCR Super Mix：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀：MultiskanMk3型，美國(guó)ThermoFisher公司；

熒光定量PCR儀：CFX96型，美國(guó)Bio Rad公司；

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：TC-2323型，美國(guó)Shldon公司；

光學(xué)顯微鏡：IX71型，日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 4-羥基苯乙酸對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響 采用CCK-8法。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 RAW264.7細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104mL-1，以100 μL/孔接種于96孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)液。細(xì)胞分為空白組(0.1% DMSO無血清培養(yǎng)液)，不含細(xì)胞的培養(yǎng)液為對(duì)照組，以及6.25，12.50，25.00，50.00 μg/mL 4-HPAA 的試驗(yàn)組，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分別加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h。于微量振蕩器上振蕩5 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔OD450 nm值，記錄數(shù)值。按式(1)計(jì)算細(xì)胞存活的百分?jǐn)?shù)。

(1)

式中：

C——細(xì)胞存活率，%；

A1——試驗(yàn)組吸光度；

A0——空白組吸光度；

A2——對(duì)照組吸光度。

1.2.2 RAW264.7細(xì)胞M1極化模型的建立與試驗(yàn)分組

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7以 1×105個(gè)/mL接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到35%～50%時(shí)分為以下3組：空白對(duì)照組加入無血清培養(yǎng)液；模型組加入LPS(100 ng/mL)和 IFN-γ(20 ng/mL)，誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞的形成；干預(yù)組加入LPS(100 ng/mL)和 IFN-γ(20 ng/mL)，同時(shí)加入終質(zhì)量濃度為6.25或12.50 μg/mL 的4-HPAA干預(yù)，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型的建立與試驗(yàn)分組

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106mL-1，以2 mL/孔接種于放有無菌細(xì)胞爬片的6孔板中。待細(xì)胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h后分為以下3組：對(duì)照組加入無血清培養(yǎng)液；模型組加入80 μg/mL的ox-LDL，誘導(dǎo)細(xì)胞攝入脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞；干預(yù)組加入80 μg/mL的ox-LDL，同時(shí)加入終質(zhì)量濃度為6.25或12.50 μg/mL的4-HPAA干預(yù)，孵育24 h后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.4 炎癥因子的分泌檢測(cè) 采用ELISA法。干預(yù)結(jié)束后收集細(xì)胞上清液，5 000 r/min離心20 min，吸取上清液，使用相應(yīng)的ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白的水平。

1.2.5 油紅O染色 將細(xì)胞接種于鋪有蓋玻片的6孔板中，給藥24 h后，移除培養(yǎng)基，PBS 沖洗3次，10%甲醛溶液固定3 h，PBS清洗一次，60%異丙醇放置30 s。吸去異丙醇溶液，加入2 mL 0.5%油紅O異丙醇溶液并于60 ℃烘箱中染色30 min。60%異丙醇清洗30 s，蒸餾水清洗3次。蘇木素染色5 min，蒸餾水洗5 min。1%鹽酸—乙醇分色30 s，PBS返藍(lán)10～15 min。用10 μL 50%甘油水溶液封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.6 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇酯含量的測(cè)定 棄去培養(yǎng)液的細(xì)胞用PBS清洗2遍，每孔加入100 μL 1% TritonX-100裂解液，4 ℃裂解30 min，參照試劑盒步驟測(cè)定總膽固醇和游離膽固醇含量，膽固醇酯含量為總膽固醇和游離膽固醇的差值。采用BCA試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白含量。

1.2.7 基因表達(dá)水平測(cè)定 RAW264.7巨噬細(xì)胞按1.2.2和1.2.3造模和分組作用24 h后，傾去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗3次，Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)cDNA，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)基因(IL-6、TNF-α、IL-1β、ABCA1、ABCG1和CD36)的表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件為95.0 ℃預(yù)變性5 min；95.0 ℃變性30 s，60.0 ℃ 退火30 s，72.0 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束前系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè)熒光產(chǎn)物的量，所有循環(huán)結(jié)束后，繪制溶解曲線以判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。引物由廣州銳博生物科技公司設(shè)計(jì)并合成(見表1)。

表1 RT-PCR檢測(cè)引物Table 1 Primer name and sequence

1.3 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果以mean±SD表示(n=4)。采用SPSS 22.0軟件，單因素分析方法(ANOVA)進(jìn)行顯著性分析，字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 4-HPAA對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

由圖1可知，當(dāng)4-HPAA和細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h時(shí)，濃度為6.25～100.00 μg/mL的4-HPAA對(duì)細(xì)胞活性無顯著影響，巨噬細(xì)胞存活率均在95%以上。

圖1 4-HPAA對(duì)細(xì)胞活力的影響Figure 1 Effect of 4-HPAA on RAW264.7 viability

2.2 4-HPAA對(duì)M1型極化巨噬細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子的影響

巨噬細(xì)胞向M1型極化后會(huì)分泌大量炎癥細(xì)胞因子。由表2可知，與對(duì)照組相比，M1型極化巨噬細(xì)胞模型組炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌量均顯著升高(P<0.05)，表明M1型極化模型建立成功。與模型組相比，4-HPAA顯著降低了炎癥細(xì)胞因子的分泌水平(P<0.05)，其中當(dāng)濃度為12.50 μg/mL時(shí)，4-HPAA組的TNF-α、IL-6和IL-1β分泌量分別降低為M1型極化巨噬細(xì)胞模型組的60.78%，38.03%，39.35%(P<0.05)。原花青素[20]、山奈酚[21]、榴蓮殼多酚[22]等多酚類化合物具有抗炎癥作用，其腸道菌群代謝物4-HPAA可能在其中發(fā)揮了重要作用。

表2 4-HPAA對(duì) M1型極化巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子的影響

2.3 4-HPAA對(duì)M1型極化巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)的影響

由圖2可知，與空白組相比，M1型極化巨噬細(xì)胞模型組的TNF-α、IL-6和IL-1β3種極化相關(guān)標(biāo)志基因mRNA的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；加入4-羥基苯乙酸干預(yù)后，與M1型極化組相比，TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA的表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，其降低程度與4-HPAA 濃度呈正相關(guān)。說明4-HPAA干預(yù)后可抑制LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1型極化。韓淇安等[23]發(fā)現(xiàn)鞣花酸的腸道菌群代謝產(chǎn)物尿石素A能抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1型極化。表明腸道菌群代謝物抑制巨噬細(xì)胞向促炎的M1型極化可能在多酚預(yù)防和改善動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的過程中起到了重要作用。

圖2 4-HPAA對(duì)M1型極化巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)的影響Figure 2 Effect of 4-HPAA on M1 macrophage signature gene expression

2.4 4-HPAA對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的影響

由圖3可知，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)未見染紅的脂滴，巨噬細(xì)胞被80 μg/mL的ox-LDL孵育24 h后，細(xì)胞數(shù)量減少，胞體內(nèi)有大量的脂滴排列在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，有少量細(xì)胞破裂且脂滴外溢，細(xì)胞泡沫化現(xiàn)象嚴(yán)重。與泡沫細(xì)胞模型組比較，不同濃度的4-HPAA干預(yù)均能顯著降低細(xì)胞染紅程度，高濃度組抑制細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的效果顯著高于低濃度組。原花青素[24]、山奈酚[25]、石榴皮多酚[26]等多酚類化合物具有抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的作用，改善脂質(zhì)代謝異常是多酚防治動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。

1. 對(duì)照組 2. ox-LDL泡沫細(xì)胞模型組 3. ox-LDL+6.25 μg/mL 4-HPAA組 4. ox-LDL+12.50 μg/mL 4-HPAA 組

2.5 4-HPAA對(duì)RAW264.7細(xì)胞膽固醇含量的影響

由圖4可知，與對(duì)照組相比，80 μg/mL的ox-LDL處理巨噬細(xì)胞24 h后，巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量顯著升高(P<0.05)；與空白對(duì)照組相比，泡沫細(xì)胞模型組膽固醇酯含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，4-HPAA顯著降低了巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量，且隨著4-HPAA濃度的增加，其降低作用更明顯(P<0.05)，其中12.50 μg/mL 4-HPAA組的膽固醇酯含量降低至泡沫細(xì)胞模型組47.30%。與模型組相比，4-HPAA組細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇含量有所降低，但無顯著性差異，表明巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中聚集的脂質(zhì)以膽固醇酯為主，當(dāng)膽固醇酯含量超過50%時(shí)，巨噬細(xì)胞成為泡沫細(xì)胞[27]，4-HPAA主要通過降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的聚集進(jìn)而抑制泡沫細(xì)胞的形成。

圖4 4-HPAA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膽固醇含量的影響

2.6 4-HPAA對(duì)RAW264.7細(xì)胞膽固醇代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖5可知，各組ABCA1表達(dá)無顯著變化，與泡沫細(xì)胞模型組相比，4-HPAA顯著上調(diào)ABCG1基因表達(dá)水平，顯著下調(diào)CD36基因表達(dá)水平。4-羥基苯乙酸通過下調(diào)巨噬細(xì)胞的CD36和上調(diào)ABCG1基因表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇攝入并增加膽固醇的流出，減少巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積，抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[28]。石榴皮等多酚提取物[29]通過提高ABCA1和/或ABCG1的表達(dá)引起的膽固醇流出增加，進(jìn)而抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化。

圖5 4-HPAA對(duì)巨噬—泡沫細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 結(jié)論

試驗(yàn)以多酚腸道菌群代謝物4-羥基苯乙酸為對(duì)象，探討其對(duì)M1型巨噬細(xì)胞極化及巨噬細(xì)胞泡沫化的影響及相關(guān)機(jī)制。結(jié)果表明，4-羥基苯乙酸通過下調(diào)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)，降低炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌，抑制RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞向促炎的M1型巨噬細(xì)胞極化；油紅O染色發(fā)現(xiàn)4-HPAA能顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)巨噬—泡沫細(xì)胞形成，并顯著降低膽固醇酯含量(P<0.05)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)表明4-HPAA能顯著上調(diào)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G1、下調(diào)CD36基因的表達(dá)。說明4-羥基苯乙酸能抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化，同時(shí)能夠抑制巨噬—泡沫細(xì)胞形成。由于多酚具有相對(duì)較低的生物利用度，說明其腸道菌群代謝物可能在其改善動(dòng)脈粥樣硬化的過程中發(fā)揮著重要的作用，腸道菌群代謝物4-羥基苯乙酸的生物利用度、效應(yīng)部位和分子機(jī)制等還有待于進(jìn)一步研究。